新冠病毒的肆虐引发了对疫苗的迫切需要,疫苗研发从常规的8~10年缩短至1~2年,对加速整个疫苗研发及工艺流程提出了新的技术要求。作为疫苗研发的神器,Octet®分子互作分析系统在新冠疫苗研发中大显神威,知名的几个新冠疫苗研发过程中都有它的身影,而且Octet®采用的生物层干涉(BLI)技术也是美国药典中用于结合活性和定量检测的标准方法[1],能够从以下几个方面加速疫苗研发:
疫苗的快速浓度测定
疫苗的结合活性研究
疫苗效果评价和机制研究
残留物测试
疫苗浓度的快速测定
将针对疫苗的受体或抗体固化在传感器上,然后快速检测疫苗效价(浓度),整个实验可以在10分钟内完成,检测浓度范围在0.1 - 1000 ug/mL,覆盖疫苗生产过程中的浓度范围,样品往往不需要稀释。目前BLI技术广泛用于HPV以及流感等疫苗的浓度测定,非常适合疫苗生产的中间过程以及成品快速QC。
生物膜层干涉技术的对疫苗浓度测定过程(以流感疫苗为例)[2]
只需要四步:
1. 将能够结合病毒的受体或者抗体固化在传感器上(比如唾液酸糖是流感病毒的受体),1-3分钟;
2. 用样品的基质平衡, 1-2分钟;
3. 结合含有分析物的样品,2-5分钟;
4. 分析:根据结合曲线的起始斜率计算样品浓度。
左:流感疫苗不同浓度下的结合曲线
右:流感疫苗的浓度与信号的标准曲线
某疫苗生产企业用BLI技术(蓝色)和ELISA(红色)检测发酵上清中某型HPV疫苗,对比发现,两者的结果非常接近,并且BLI速度较快,所以BLI技术已替代ELISA用于HPV疫苗生产中间控制。
新冠疫苗结合活性研究
基于重组蛋白或者mRNA的新冠疫苗一般是Spike蛋白结构域,与受体ACE2的结合活性可反映其构象的正确性,是产生中和抗体的前提。Octet®在测结合活性方面具备更多优势:
实时非标记,直接检测疫苗和受体的结合,没有洗涤步骤的干扰
测试速度快,一般10分钟内结束
可以计算结合速率常数和解离速率常数,对结合活性更加定量化
与其他技术相比,无流路,操作简便,通量高,维护简单,耗材便宜
Novavax公司的NVX-CoV2373是一种新冠纳米颗粒疫苗,由三聚体的全长的SARS-CoV-2的S蛋白和Matrix-M1佐剂组成,已获批上市。S1/S2亚基剪切位点682-RRAR-685突变到682-QQAQ-685,以及位于CH的986/987位氨基酸残基突变成了脯氨酸。Octet®检测该疫苗与ACE2的结合是非常强的,解离明显慢于野生型S蛋白[3]。
NTA传感器固化ACE2,与不同浓度的野生型S蛋白以及疫苗NVX-CoV2373结合
全球第一个上市的mRNA新冠疫苗BNT162b2(辉瑞&BioNTech),也使用Octet®检测其表达产物与ACE2的亲和力(nM级别),并且和已知中和抗体B38也有结合[4],说明其维持了中和抗体表位。所以,Octet®可以通过检测结合活性来对mRNA疫苗的基因序列进行筛选。
Octet ® RED384系统,用SA传感器固化avitag的ACE2-PD,用proG传感器固化抗体,与不同浓度的P2 S(疫苗表达产物)检测亲和力,两者的亲和力在nM级别。
疫苗评价——
血清中抗体效价的确定
针对疫苗的免疫血清的效价测试也是判断疫苗免疫原性的重要指标。一般将疫苗固化在传感器上,直接检测不同稀释度的免疫动物/人血清,快速检测血清中抗体的效价,并可以通过计算解离常数或者结合信号获知抗体的结合能力。传统方法只能获得效价,而无法获得抗体的结合能力。Octet®可以在1个小时内完成80份血清样品的检测。
不同RSV F蛋白构造体用不同佐剂免疫动物后的血清效价,结合信号越高说明血清效价越高[5]。
疫苗评价——
保护性抗原表位检测
通过检测疫苗与一系列已知表位的中和抗体的亲和力,获知疫苗是否保持了正确的构象,并判断诱导中和抗体表位的能力。主要用于亚单位疫苗和VLP疫苗。
基于RSV F蛋白的疫苗构造体与已知结合表位的抗体的亲和力测定,选择尽可能与所有中和抗体结合的疫苗构造体[6]。
Summary
- BLI法利用疫苗的结合速率,可快速测定疫苗效力或者产量
- 直接检测粗样品,适合检测亚单位(蛋白,多糖)疫苗,灭活或者减活病毒疫苗的生产过程中间控制
- 宽广的线性检测范围,大多数样品不需要稀释,或者稀释倍数较低,尽可能减少稀释带来的误差
- 全自动且步骤少,可以保证良好的重复性
- 基于结合动力学的检测更直接,结果更准确
- 可以信号放大,从而检测HCP等残留物
-参考文献-
2021版美国药典,通则, 通则
Universal label-free In-process Quantification of Influenza Virus-like particles[J]. Biotechnology Journal, 2017:1700031.
SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 elicits immunogenicity in baboons and protection in mice.www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.29.178509v1
A prefusion SARS-CoV-2 spike RNA vaccine is highly immunogenic and prevents lung infection in non-human primates. bioRxiv, doi:https://doi.org/10.1101/2020.09.08.280818
Adjuvants and the vaccine response to the DS-Cav1-stabilized fusion glycoprotein of respiratory syncytial virus.PLoS ONE 12(10): e0186854.
Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.Science 342, 592 (2013);
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