免疫学测定方法（Western blot） 操作流程

Western blot 操作流程

实验原理

    Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

内参:

    WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。

1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的；

2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；