ELISA试剂使用过程中常见问题解答 |
现象 | 可能原因 | 解决方法 |
(一) 显色淡,灵敏度低 | 1、试剂盒没有按规定进行保存,受高温影响; | 不要将试剂盒长时间置于常温下,按使用规定储藏。
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2、试剂盒超过有效期; | 不要使用。 |
3、试剂、样品用前未能平衡; | 用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右 |
4、移液器计量不准,吸嘴内水份太多或不清洁;
| 校正移液器,移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快,排放应完全。吸嘴最好一次性使用。 |
5、培养箱温度不到37℃; | 反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。保温期内不宜多开门,以免影响保温。
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6、保温时间不够; | 定时钟准确定时。 |
7、洗涤冲击力太大。洗涤液浸泡时间太长,洗涤次数过多; | 减小洗涤冲击力,按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。 |
8、显色剂加量不足或顺序颠倒,或混合后加入; | 滴加显色剂时,滴瓶垂直向下,持力均匀,滴速不宜过快,先加显色剂A,后加显色剂B,不可将A、B液混合后加入。 |
9、底物作用时间不够; | 准确定时。 |
10、蒸馏水水质有问题; | 测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。 |
11、样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应; | 样品中不能加入NaN3。 |
(二) 重复性差 | 1、样品数量不一,加样时间长短不一; | 重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近。 |
2、样品加入后未混匀; | 加样后在混匀器上充分混匀。 |
3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对; | TMB显色用450/630波长. |
4、酶标仪测定重复性差; | 校对酶标仪。 |
5、洗涤不正确; | 用洗涤液注满各孔,但不要溢出。洗板时反应板面向下,垂直用力甩净内容物(可多甩几次),在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分。
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6、温育条件不一致(一次用水育,一次用恒温箱) | 恒温箱温育较水浴显色深,OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。 |
7、不慎多加或少加酶或显色剂; | 多加时显色深,少加则浅,用记号笔圈上,便于分析。 |
8、阈值附近时阴时阳; | 同一样品做三个复孔,以二个(含二个以上相同结果为准 |
9、加样量不一致; | 尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致可能性。 |
10、保温时间不一致; |
11、洗涤条件不一致; |
12、操作人员不一致; |
(三) 出现一片白,阳性对 照不显色 | 1、蒸馏水有问题; | 与好的蒸馏水比较。 |
2、洗涤液配制不误; | 按说明书配制。 |
3、终止液误作洗涤液稀释; | 每次配制时都应看清标签标明物质。 |
4、终止液当底物缓冲液配制; |
5、漏加酶; | 注意不要漏加 |
6、漏加显色剂A或B; | 加显色剂后观察一个液面高度。 |
7、某一容器未洗净,残留有灭活酶物质; | 尽可能用试剂盒内容器,另觅的一定要洁净,可靠 |
(四) 全部呈有色 | 1、水质问题; | 防止蒸馏水污染。 |
2、加酶量过多(如 50uL误认为100uL)或丙肝酶稀释时加量过多; | 加酶前检查移液器调节量是否准确,稀释酶时思想要集中。 |
3、培养箱温度超过37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过; | 放入板以前要检查培养箱的温度,准确定时。 |
4、洗涤不充分,样品中有其他成残留,或有残留酶。
| 充分洗涤。 |
5、底物配制时间过长、或底物污染; | 底物应在酶反应完毕即将洗涤前5分钟配制,注意避光。 |
6、该批样品放置时间过长,样品污染; | 样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染。 |
7、移液嘴重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物; | 移液嘴尽可能一次性使用。 |
(五) 花板 | 1、操作不慎; | 按说明书洗板,加样,显色。洗板尤为重要。 |
2、洗板机堵孔,残留液较多,加洗液及抽吸洗液不均匀。 | 检查洗板机,并进行调整。 |
3、样品离心处理不完全,反映孔内发生凝血或残留细胞成分; | 充分离心,3000rpm6分钟以上。 |
(六) 显色顺序 前后不均
| 1、批样品量过大,加试剂时间过长,反映时间不一致; | 采用多通道连续移液器以缩短加试剂时间或控制每批样品量。 |
1、不同厂家生产的试剂盒因生产工艺和操作方法略有不同,请用户务必按所用试剂盒说明书严格操作。否则易产生检测结果的不确定性。 2、若不同批号试剂的不同组分(A液或酶工作液),或不同试剂的不同组分进行交叉使用,有可能出现显色浅或本底高,花板等情况。 3、反应板出现一片白或一片有色(包括阴阳性对照),大多数是实验室中某一环节发生问题;若逐一排除可能性仍出现上述情况,可与另一批号试剂盒进行对照以排除试剂盒质量问题的可能性。 |