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免疫荧光实验的几个问题
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简介:1、问:做间接法免疫荧光染色,要怎么设置对照? 参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色。 (1)空白对照:如果你作的是石蜡切片的免疫组化,这一个对照必须有,目的是看自发荧光。脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
简介:1、问:做间接法免疫荧光染色,要怎么设置对照? 参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色。 (1)空白对照:如果你作的是石蜡切片的免疫组化,这一个对照必须有,目的是看自发荧光。脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。 (2)阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应。 (3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应。 2、问:免疫荧光:用免疫荧光方法做同样的内容,组织切片和培养细胞,两者操作过程中有哪些不同? 参考见解:只是固定方法不同,细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的。 (1)你的二抗是用FITC标记的,为避免荧光分解,分装及荧光显微镜观察时均要避光。 (2)封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氢盐缓冲液,后者能使玻片透明更亮。 (3)关于免疫酶染色,如果是用过氧化物酶做标记,就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶。 (4)如果要做苏木素复染,可用盐酸溶液去除苏木素。 3、问:近期要做免疫荧光双标,不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项? 参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双染。有些体会: (1)选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,secondary antibodies则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 (2)我的做法是两种primary antibodies同时孵育,然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好,背景比较干净。 (3)我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 (4)Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清,我的是10%的正常donkey血清。 (5)其余同一般操作。 4、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色,结果用激光共聚焦显微镜看很好,有阳性信号,阴性对照组也没有荧光,但是拿到荧光纤维镜下看,我的阴性对照组一片绿,像非特异性染色,到底哪个结果才是真实的呢? 参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多,出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题,如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因,荧光显微镜没有问题,那就以共聚焦显微镜的结果为主。抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验。
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