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简介:使用说明: 1. 取培养过夜的酵母1.5毫升,5000g离心1分钟收集酵母沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集3毫升培养过夜的酵母。 再在离心机快速离心一下(5000g离心1-2秒),用移液器小心吸尽残余液体。 通常酵母宜30°C培养过夜(16-24小时左右)。
简介:使用说明: 1. 取培养过夜的酵母1.5毫升,5000g离心1分钟收集酵母沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集3毫升培养过夜的酵母。 再在离心机快速离心一下(5000g离心1-2秒),用移液器小心吸尽残余液体。 通常酵母宜30°C培养过夜(16-24小时左右)。建议5000g(~5000-6000rpm)室温离心1分钟,如沉淀不充分则适当延长离心时 间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于后续加入溶液I后充分重悬沉淀。直接倒掉上清,再倒入约1.5毫 升酵母液并重复上述的离心操作,然后直接倒掉上清,再在离心机快速离心一下(5000g 1-2秒),用移液器小心吸尽残余液 体。残余液体必须吸尽,否则可能会干扰后续的酶解反应。如果酵母密度明显偏低,可考虑使用更多酵母液,再重复上 述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超过5ml。过量的酵母会导致后续的酶解和碱裂解不充分。 2. 每管加入100微升酶解缓冲液,重悬酵母沉淀。确保沉淀完全散开,无可见酵母团块。 可以通过剧烈Vortex来重悬沉淀。 3. 加入20微升配制好的Lyticase溶液,充分混匀,30℃水平摇床200-250rpm孵育0.5-1小时。。 注意:根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同,酶解的孵育时间可进行适当调整。当酵母用量较大时,酶解的孵育时间需 延长。孵育时间延长到2-3小时通常不会对质粒抽提带来负面影响。 4. 1500g (~3000-4000rpm)离心10钟,弃上清,收集沉淀。 直接倒掉上清,然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸),使液体流尽。也可在直接倒掉上清后再在离心机内甩一下,用移液 器吸尽残留液体。不同离心机因离心半价的不同g和rpm的换算值有所不同。 5. 每管加入250微升溶液I,重悬酵母沉淀。确保沉淀完全散开,无可见酵母团块。 确认溶液I中已经添加了RNase A。由于此时酵母细胞壁已经去除,重悬操作要温和,不宜剧烈振荡,否则会容易导致基 因组DNA的污染。但同时必须保证沉淀充分散开,即必须确保酵母细胞充分分散到溶液中。 6. 每管加入250微升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,使菌体完全裂解,溶液透明。 切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。遇到有少量团块或 絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数3-5次,再室温放置2-3分钟,但总裂解时间不可超过5分钟。 7. 每管加入350微升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。 切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致最终所得质粒的质量下降。 8. 最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。 离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱,废液收集管,并在纯化柱上做好标记。 9. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒,倒弃收集管内液体。 质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。 10. 在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV,最高速离心30-60秒,洗去杂质,倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。 11. 最高速再离心1分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。 12. 将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上,加入50微升溶液V至管内柱面上,放置1分钟。 溶液V 需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液 V 沾在管壁上,一定要震动管子,使液体滑 落到管底,以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 级纯水替代溶液V,但是水的pH 应不小于6.5。溶液V 加入后 放置时间稍长,对于增加质粒产量会略有帮助。 13. 最高速离心1分钟,所得液体即为高纯度酵母质粒。
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