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简介:钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器
简介:钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待 检测,其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔,在第一、第二孔中分别加标 准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二 孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl, 混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉,再各取50μl 分别加到第五、第六孔 中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各 取50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混 匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl, 浓度分别为180 pg/ml,120 pg/ml ,60 pg/ml,30 pg/ml,15 pg/ml)。 2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样 品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混 匀。 3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液:将30(48T 的20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T 的20 倍)倍稀释后备用。 5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此 重复5 次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。 7. 温育:操作同3。 8. 洗涤:操作同5。 9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。 11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止 液后15 分钟以内进行。 注意事项: 1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未 用完,板条应装入密封袋中保存。 2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。 3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值 大于标准品孔第一孔的OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计 算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。 5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
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