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在吸光光度分析中，导致偏离朗伯-比尔定律的原因很多，但基本上可分为物理和化学两个方面。属于物理原因的主要是入射光的单色性不纯所造成的；化学方面主要是由于溶液本身化学变化造成的。
（1） 单色光不纯引起的偏离
严格说来，朗伯-比尔定律只适用于单色光。但由于仪器分辩能力所限，入射光实际为一很窄波段的谱带，即在工作波长附近或多或少含有其他杂色光。这些杂色光将导致朗伯-比尔定律的偏离。
（2） 溶液本身引起的偏离
溶液本身引起的偏离有以下原因：
1）溶质和溶剂的性质。碘在四氯化碳溶液中呈紫色，在乙醇中呈棕色，在四氯化碳溶液中即使含有1％乙醇也会使碘溶液的吸收曲线形状发生变化。溶液的折光指数（n）随溶液的浓度改变而变化，并对吸光度有影响。当溶液浓度低于0.01mol／L时，n基本上是一常数，这也说明朗伯-比尔定律只有在低浓度中应用才是正确的。
2）介质不均匀性。朗伯-比尔定律是适用于均匀、非散射的溶液的一般规律，如果被测试液是胶体溶液、乳浊液或是浊液，则入射光通过溶液后，除了一部分被试液吸收，还会有反射、散射使光损失，导致透光率减小，吸光度异常增大，造成对朗伯-比尔定律的偏离。
3）溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化。离解是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素。溶液浓度的改变，离解程度也会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。
溶液中有色质点的聚合与缔合，形成新的化合物或互变异构等化学变化以及某些有色物质在光照下的化学分解、自身的氧化还原、干扰离子和显色剂的作用等，都对遵守朗伯-比尔定律产生不良影响。
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