常规反相色谱柱安装及使用维护指南

常规反相色谱柱安装及使用维护指南

何谓常规反相色谱柱

那些在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C 18 、C 8 、C 4 或苯基等键合相的色谱填料所装填的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C 18 柱是最常使用的反相色谱柱之一。

新色谱柱开启和安装的推荐步骤：

1.使用新鲜洁净的水与乙腈。冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

2.取用色谱柱时避免磕碰掉落。

3.将色谱柱入口端连接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头标明正确流向。

4.在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。

5.当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上(这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡)。

6.重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。

7.参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。

8.测试柱效。如果没有柱效测试报告中的分析物，请联系沃特世化学消耗品部门寻求支持，使用合适的浓度与进样量。柱效结果略低于柱效测试报告属正常情况。如结果明显偏低、峰形拖尾，提示色谱柱和/或所使用的液相系统处于非理想状态，需要进行故障排查。

当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径(如0.005’’或0.12mm)的系统管路。并确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积。

当使用小颗粒填料(如2.5μm)短柱进行高效快速分离时，需要考虑以下因素：

1、确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；

2、提高采样频率至10点/秒以上；

3、较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况调节流速；

4、可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40?C。使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45?C或更高。

进行实际样品分析的推荐步骤：

1.确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。确保实验室纯水系统工作正常。

2.确保样品不含颗粒型杂质。如样品过脏，或有微粒存在，需要考虑适合的样品制备方法。在使用样品过滤器时，确保滤膜为0.22μm，且与样品溶剂完全兼容(不发生溶解)。也可考虑使用高速离心法去除颗粒性杂质，例如8000rpm转速以上离心20分钟后，移取样品上清液进样。

3.确保样品溶液与流动相条件兼容，进样后不会发生沉淀、或溶剂不互溶情况。通常使用流动相或比流动相洗脱强度弱的溶液(即有机溶剂比例较低)溶解或稀释样品，这样可以获得最好的峰形和检测灵敏度。

4.如系统在线混合生成流动相，预先检查流动相各组分的兼容性。例如，当磷酸盐缓冲液与高浓度乙腈(例如≥70%)混用时，可能发生盐析出。

5.了解色谱柱的操作使用限度。如果所使用的流动相条件、柱温、以及样品溶液条件，不利于色谱柱寿命时，请使用保护柱以延长柱寿命。

6.在使用流动相进行柱平衡之前，如果流动相中含有可能析出的缓冲盐，先使用5倍柱体积的有机溶剂-水溶液进行过渡。例如，在使用40/60甲醇/磷酸盐缓冲液流动相之前，先使用5倍柱体积的40/60甲醇/纯水溶液冲洗色谱柱。

7.在常规分析过程中，每针或间隔若干针清洗柱内可能积累的污染物。完成分析后，彻底清洗色谱柱，除去柱内缓冲盐和污染物。

8.在色谱柱使用过程中，定期进行柱效测试，记录塔板数与压力，从而追踪监控色谱柱的性能变化。柱效测试方法应固定。

9.反相色谱柱应保存于合适的高比例或100%有机相(如乙腈或甲醇)中。如色谱柱使用于高温或极端PH条件，或停用色谱柱超过72小时，用100%乙腈保存色谱柱。

10. 使用原配的柱堵头，确保堵头拧紧以避免柱内溶剂挥发。取放色谱柱时避免磕碰掉落。

柱清洗与再生的推荐步骤：

压力升高，色谱柱峰形发生变化如出现严重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分离度降低，这些都强烈提示色谱柱受到污染。可采用以下步骤处理：

1.如系统接有在线过滤器和保护柱，首先排查在线过滤器与保护柱，进行更新替换。日常操作中，当压力升高10%或柱效降低10%时，就应考虑更换在线过滤器和/或保护柱。

2.使用高比例的有机溶剂进行冲洗(请注意避免盐析出，通常可使用梯度升高法，然后维持在高比例甚至100%有机溶剂条件下)。此操作通常可洗去大部分污染物。

3.如有机溶剂清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱的清洗和再生。根据样品性质以及你所了解的污染物性质选择清洗方法，用20倍柱体积(即，对于4.6x250mm柱，相当于80mL)的HPLC级溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35-55?C可提高清洗效率。

* 注意防止缓冲盐析出，可调整为适当比例的异丙醇和水的混合溶液

** 除非确保您的系统与四氢呋喃和正己烷完全兼容，否则四氢呋喃或正己烷只有在

色谱柱无法用反相有机溶剂如乙腈清洗干净时才考虑使用。降低流速及操作温度，

并尽量减少系统在四氢呋喃和正己烷中的暴露时间。

4.可以考虑对色谱柱进行倒冲，特别是当问题表现为压力急剧升高，提示有颗粒型物质直接堵塞于色谱柱入口端筛板处时。操作时，将色谱柱倒接，并与检测器断开。使用低流速0.2ml/min，进行过夜冲洗，并封堵检测器入口及出口端以免溶剂挥干产生气泡。甚或，将色谱柱小心的打开，直接更换柱入口端筛板。注意！这类操作需要技巧，仅作问题确实无法得到有效解决时的最后尝试，或供某些经验丰富的分析操作人员参考使用。