用高分离度快速液相色谱-UV 和 MS 检测建立可靠的中药制剂质控方法 (PDF)

中国长期使用中药和中药制剂，对 其治疗作用有丰富的经验。但质量 控制仅局限在外观检查是不够的。 随着新技术的发展，已经发现某些 中药中有几百种化合物，其浓度范 围很宽。而且，产地不同和采摘时 期不同，以及炮制和加工工艺不同， 中草药的成分也不同。因此，对中 药化合物的质量控制极具挑战性。 现在，只测定中药制剂中一个或两 个成分进行质量控制已经不够了， 因为特殊配方的中药制剂都是由一 种以上中药组成的。例如，芪参益 气滴丸，一种用于治疗冠心病的中 成药，包含4种中药： • 黄芪 • 丹参 • 三七 • 降香 本研究以芪参益气滴丸为样品，用 高分离度快速液相色谱（RRLC）- 紫外-可见检测器和质谱联用，建 立中药质量控制的新方法。主要目 标是建立一种可靠的方法，能够选 测定在加热和混合过程中不变的潜 在目标化合物。 用高分离度快速液相色谱-UV和MS检测，建立可靠的中药制剂质控方法 摘要 安捷伦仪器： 1200系列高分离度快速液相色谱系统 6140四极杆质谱仪 本应用报告报导了用高分离度快速液相色谱法紫外-可见检测器和四极杆质谱联用，分析各种中药(TCM)及中药制剂，建立可靠的质控方法。对不同中药用UV和MS检测所得到的色谱图进行了比较，将UV和MS图谱结合进行目标化合物的鉴定。 应用领域： 中药 中国长期使用中药和中药制剂，对其治疗作用有丰富的经验。但质量控制仅局限在外观检查是不够的。随着新技术的发展，已经发现某些中药中有几百种化合物，其浓度范围很宽。而且，产地不同和采摘时期不同，以及炮制和加工工艺不同，中草药的成分也不同。因此，对中药化合物的质量控制极具挑战性。现在，只测定中药制剂中一个或两个成分进行质量控制已经不够了，因为特殊配方的中药制剂都是由一种以上中药组成的。例如，芪参益气滴丸，一种用于治疗冠心病的中成药，包含4种中药： ·黄芪 ·丹参 ·三七 ·降香 本研究以芪参益气滴丸为样品，用高分离度快速液相色谱(RRLC)-紫外-可见检测器和质谱联用，建立中药质量控制的新方法。主要目标是建立一种可靠的方法，能够选测定在加热和混合过程中不变的潜在目标化合物。 仪器 ( ·Agilent 1200系列 RRLC系统包 括：带真空脱气机的SL型二元泵、SL型高性能自动进样器、配置微量流通池(2uL体积，3 mm 光程)的SL型柱温箱和二极管阵 列检测器SL， ) ·Agilentt6410四极杆质谱仪，配置ESI离子源 ( ·Agilent 化学工作站B.02.01 SR1， 用于数据采集和分析 ) ( ·Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT 色谱柱， 3.0 x 50 mm， 1.8 um 粒径 ) 标准品 丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参素、三七皂甙R1和黄芪甲苷均购自中国药品生物制品检定所 (NICPBP)， 人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、原儿茶醛、原儿茶酸、人参皂甙 Re和人参皂甙Rc 购自Sigma-Aldrich公司(美国)。 溶剂 乙腈购自Fisher公司(美国)， 结果与讨论水由Milli-Q纯水系统制备。 样品和样品制备 芪参益气滴丸、黄芪、丹参、三七的中间提取物，及降香精油，由中国TASLY制药公司提供。原药材购自当地中药店。 滴丸、中药提取物和中药原料溶于70%甲醇/水溶液中，超声提取30分钟，用0.22 um滤膜过滤。 ( RRLC方法 ) ( ·流动相： ) ( A： 0.1%甲酸水 ) ( B：乙腈，含0.1%甲酸 ) ( ·梯度：0分钟，10 %B；8分钟， 38 %B； 12分钟，100 % %B； 持 续3分钟，然后10%B ) ( ·流速：1.0 mL/min(被动分流器将进入MS的流速降至 0.4mL/min) ) ( ·柱温：45C ) ( ·检测波长：203nm ) ( ·峰宽：0.5s ) ·狭缝宽度：4nm ( ·光谱：190-400nm， 2nm步进 ) ( 质谱方法 ) ( ·扫描：80-1400(正/负) ) ( ·碰撞诱导解离电压：70(正/负) ) ( ·干燥气体： 12L/min ) ·雾化器压力：50 psi ·干燥气温度：50°C ( ·毛细管电压：3200V(正/负) ) 用安捷伦方法转换计算器((光盘发行号5989-5130EN)将常规液相色谱方法转换成高分离度快速液相色谱方法。 丹参三七黄芪和降香提取物的比较 由图1可见，在203 nm检测波长下，丹参和三七的色谱图与混合提取物有很大区别。混合和加热后，某些峰消失了，同时出现了一些新的色谱峰。 目标化合物筛选是质量控制的重要步骤，可以确定加工过程中这些化合物是否发生了变化。大多数研究者都用203 nm进行检测，因为主要活性化合物是皂甙，在203nm波长下有弱吸收。但203 nm处的大峰可能与质量控制无关，那些小峰可能对研究活性成分更重要。因此，需要另一种灵敏度更高的检测器，提供这些成分的更多信息。 不同检测器和条件之间的比较 图2显示了紫外和MS检测的不同结果。在MS的总离子色谱图中有更多的峰，因为某些成分紫外吸收很弱或者没有吸收。用MS检测增加了另一维数据，并得到了这些不同化合物的结构信息。负离子模式给出了这些峰更完整的信息，，可以对质量控制的目标化合物进行鉴定。 芪参益气滴丸和不同提取物之间的比较 图3显示了丹参、黄芪和降香提取物与芪参益气滴丸(由这三种提取物和其它填加剂制成)的色谱图。标记数字的峰就是对这一中药制剂质量控制筛选到的目标化合物。根据UV和MS数据，研究不同的色谱峰，以确定这些化合物是否发生了改变。表1列出了鉴别的结果。 图1 各中药丹参、三七及混合提取物的色谱图 图2 丹参三七组合的色谱图， UV和MS检测得到了不同结果 图3 三种中药组合及滴丸样品的负离子TIC比较 结论 本应用报告报导的RRLC-紫外和MS检测方法比目前药典控制单一组分的质量控制方法更可靠，因为能够根据UV和MS检测器提供的信息跟踪中药中几种成分的质量。跟踪这些成分非常重要，因为这些成分可能在炮制和加工过程中发生变化。质谱测定使用的Agilent 6140四极杆质谱仪，与Agilent 1200系列RRLC系统和Agilent化学工作站软件能够完全集成。 色谱峰化合物 MS UV入max(nm) 1 丹参素 197 [M-H]-， 395 [2M-H]- 280 2 隐丹参酮 137 [M-H]-，275[2M-H]一 225，280，310 3 丹酚酸B 717[M-H]- 260，280 4 人参皂甙 Rg1 845[M+HC00] 210 5 人参皂甙 Rb1 11071[M-H]- 210 6 黄芪甲苷Ⅳ 829[M+HC00]- 210 7 丹参酮川 295137[M+H，0] 230 表1 目标化合物的结构式和检测信息(峰号参见图3) ( 参考文献 ) ( 1. Ai-hua Liu， et.al.， Journal of Chromatography B， 846 (2007)32-41 ) ( 2. ) ( Jin-huai Liu， et.al.， Journal ofChinese Pharmaceutical Science， 2004，13(4) ) ( 3. ) ( Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005，1676-1680 ) 4. Agilent Application Notes，publication numbers 5989-4506EN，5989-5493EN，5989-6757EN 徐智秀是安捷伦科技上海有限公司的应用化学工程师。 www.agilent.com/chem/tcm @2007安捷伦科技公司 2007年12月1日印刷 发行号5989-7682CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies