海能仪器：猪和牛脂肪中孕酮残留量的测定（液相色谱法）

液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：（１）恶心、头晕、倦怠；（２）突破性出血；（３）孕期服用，会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显著和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物（非治疗用途）已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害。因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测. 1　试剂与仪器 1．1　试剂　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品，乙腈，甲醇，乙酸乙酯，其他试剂为分析纯。水由净化系统制得。 　　（１）标准储备液：１０００μｇ／ｍｌ，分别准确称取0.05ｇ 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于５０ｍｌ容量瓶中，用甲醇定容。于４℃保存，可使用一年。 　　（２）混合中间溶液Ｉ：１００μｇ／ｍｌ，分别吸取10.0ｍｌ 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于１００ｍｌ 容量瓶中，用甲醇定容。于４℃保存，可使用一年。 　　（３）混合中间溶液ＩＩ：１．０μｇ／ｍｌ，取１．００ｍｌ 混合中间溶液Ｉ于１００ｍｌ 容量瓶中，用甲醇定容。于４℃保存，可使用半年。 （４）混合标准工作液：分别吸取１０、２０、４０、８０、１００μｌ 混合中间溶液ＩＩ 添加到９８０、９７０、９５０、９１０、８９０μｌ 的乙腈－水（６５：３５）中，再加入１０μｌ ０．２％盐酸溶液，混匀，得到浓度为０．０１０μｇ／ｍｌ、０．０２０μｇ／ｍｌ、０．０４０μｇ／ｍｌ、０．０８０μｇ／ｍｌ 和０．１０μｇ／ｍｌ 混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用。 1．2　仪器　LC7000 液相色谱系统，LC7011泵体，LC7020 紫外－可见检测器，Hanon-Clarity色谱软件。氮吹仪；海能全自动固相萃取装置；低温离心机；涡旋混匀器；ＣＮ 固相萃取柱。 2　测定步骤 2．1　试样的制备与保存 2．1．1　试样的制备　把大约５ｇ 的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入１５０ｍｌ 的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热３０ ～６０ｓ，如果脂肪没有融化，可在间隔３０ ～６０ｓ 以后重复加热３０ ～６０ｓ，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记。 2．1．2　样品的保存　把熬制好的脂肪油样品置于－１８℃中，冷冻保存. 2．2　提取　称取熬制好的脂肪油２．００ ±０．０１ｇ，置于５０ｍｌ具塞离心管中，加入５ｍｌ 乙腈，于６０℃水浴中保温３ｍｉｎ 以使固体脂肪溶化，涡旋振摇１ｍｉｎ，在－５℃下离心７ｍｉｎ（离心力１１６０ｇ），吸取上清液至１５ｍｌ 带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入５ｍｌ 乙腈重复提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入２ ×２ｍｌ 正己烷，涡旋振摇１ｍｉｎ，于－５℃中离心５ｍｉｎ（离心力１１６０ｇ），弃去正己烷层。乙腈提取液于６０℃中用氮吹仪吹干，残渣待皂化。 2．3　皂化　在残渣（２．２ 项）中依次加入４ｍｌ 正己烷、１ｍｌ０．１ｍｏｌ／Ｌ 氢氧化钠溶液和０．５ｍｌ １．０ｍｏｌ／Ｌ 氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀１０ｓ，在６０℃水浴中保温１５ｍｉｎ，于－５℃中离心５ｍｉｎ（离心力１１６０ｇ），吸取上清液至１５ｍｌ玻璃试管。在沉淀物中再加入４ｍｌ 正己烷混匀后，在６０℃水浴中加热１５ｍｉｎ 后， 在－５℃ 中离心５ｍｉｎ （离心力１１６０ｇ），合并上清液。于６０℃中用氮气吹干仪吹干，用１．０ｍｌ 正己烷溶解残渣，待净化。 2．4　净化　将皂化后的样液（２．３ 项）倒入经５ｍｌ 乙酸乙酯和６ｍｌ 正己烷预处理过的ＣＮ 柱中，用２ ×１ｍｌ 正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到ＣＮ 柱中。待样液流过后，依次用５ｍｌ 正己烷和６ｍｌ ５％乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气２ｍｉｎ。最后用３．５ｍｌ ２０％乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于１５ｍｌ 玻璃试管中，于６０℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用９９０μｌ 乙腈－水（６５：３５） 涡旋溶解，静止１５ｍｉｎ 后，加入 １０μｌ ０．２％盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定。 2．5　测定 2．5．1　液相色谱条件　色谱柱：Ｃ１８ 柱（２５０ｍｍ ×４．６ｍｍ，５μｍ）；预柱：Ｃ１８ 柱（１２．５ｍｍ ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈－水（６５：３５）；流速：１畅０ｍｌ／ｍｉｎ；柱温：３５℃；检测波长：２９２ｎｍ；进样量：４０μｌ。 2．5．2　液相色谱测定　根据样液中３ 种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中３ 种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图１。 图１　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图（１００ ｎｇ／ｍｌ） １ －醋酸甲地孕酮，２ －醋酸氯地孕酮，３ －醋酸美仑孕酮 3　结果与讨论 3．1　线性范围　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在０．０１０ ～０．１０μｇ／ｍｌ 范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数（γ２ ）均大于０．９９８。 3．2　回收率、精密度和定量检测限　本实验以２ 种脂肪（牛脂肪和猪脂肪）作为样本。取适量标准品加入到２．０ｇ样品中，使添加量相当于１０、２０ 和５０μｇ／ｋｇ，每个添加水平各取２４ 份试样（每种脂肪各１２ 份）。图２ 为空白脂肪样品和添加样品（１０μｇ／ｋｇ）的色谱图。表１ 为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表２ 为８ 家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限（ＬＯＱ），ＬＯＱ 为１０μｇ／ｋｇ，满足残留限量的检测要求。 （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （Ｄ） 图２　空白脂肪样品和添加样品（１０（ｇ／ｋｇ）的色谱图 Ａ：牛脂肪空白样；Ｂ：猪脂肪空白样；Ｃ：牛脂肪添加样；Ｄ：猪脂肪添加样 PAGE - 1 -