本实验以2 种脂肪(牛脂肪和猪脂肪)作为样本。取适量标准品加入到2.0g样品中,使添加量相当于10、20 和50μg/kg,每个添加水平各取24 份试样(每种脂肪各12 份)。图2 为空白脂肪样品和添加样品(10μg/kg)的色谱图。表1 为醋酸美仑孕酮,醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2 为8 家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验,能可靠测得的最低浓度确定定量检测限(LOQ)
液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物,有明显的孕激素和抗雄激素作用,可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用,动物实验表明有死胎率增加和致畸作用,副作用有:(1)恶心、头晕、倦怠;(2)突破性出血;(3)孕期服用,会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能,可以很快产生显著和直接的经济效益,因此,对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史,但人类长期食用含有激素的肉制食品,即使含量甚微,亦会明显影响机体的激素平衡,而且有致癌危险,对幼儿造成发育异常等危害。因此,开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测. 1 试剂与仪器 1.1 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品,乙腈,甲醇,乙酸乙酯,其他试剂为分析纯。水由净化系统制得。 (1)标准储备液:1000μg/ml,分别准确称取0.05g 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用一年。 (2)混合中间溶液I:100μg/ml,分别吸取10.0ml 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml 容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用一年。 (3)混合中间溶液II:1.0μg/ml,取1.00ml 混合中间溶液I于100ml 容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用半年。 (4)混合标准工作液:分别吸取10、20、40、80、100μl 混合中间溶液II 添加到980、970、950、910、890μl 的乙腈-水(65:35)中,再加入10μl 0.2%盐酸溶液,混匀,得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml 和0.10μg/ml 混合标准工作液,供液相色谱测定,当日使用。 1.2 仪器 LC7000 液相色谱系统,LC7011泵体,LC7020 紫外-可见检测器,Hanon-Clarity色谱软件。氮吹仪;海能全自动固相萃取装置;低温离心机;涡旋混匀器;CN 固相萃取柱。 2 测定步骤 2.1 试样的制备与保存 2.1.1 试样的制备 把大约5g 的猪或牛脂肪组织切成小块,然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中,放入150ml 的烧杯中,将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量,使用最大功率,加热30 ~60s,如果脂肪没有融化,可在间隔30 ~60s 以后重复加热30 ~60s,直到有液体脂肪流出,通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中,密封,并做上标记。 2.1.2 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中,冷冻保存. 2.2 提取 称取熬制好的脂肪油2.00 ±0.01g,置于50ml具塞离心管中,加入5ml 乙腈,于60℃水浴中保温3min 以使固体脂肪溶化,涡旋振摇1min,在-5℃下离心7min(离心力1160g),吸取上清液至15ml 带塞聚丙烯离心管,再在沉淀物中加入5ml 乙腈重复提取一次,合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2 ×2ml 正己烷,涡旋振摇1min,于-5℃中离心5min(离心力1160g),弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮吹仪吹干,残渣待皂化。 2.3 皂化 在残渣(2.2 项)中依次加入4ml 正己烷、1ml0.1mol/L 氢氧化钠溶液和0.5ml 1.0mol/L 氯化镁溶液,于涡旋混匀器上快速混匀10s,在60℃水浴中保温15min,于-5℃中离心5min(离心力1160g),吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml 正己烷混匀后,在60℃水浴中加热15min 后, 在-5℃ 中离心5min (离心力1160g),合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干,用1.0ml 正己烷溶解残渣,待净化。 2.4 净化 将皂化后的样液(2.3 项)倒入经5ml 乙酸乙酯和6ml 正己烷预处理过的CN 柱中,用2 ×1ml 正己烷润洗玻璃试管,洗液倒入到CN 柱中。待样液流过后,依次用5ml 正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子,随后打开真空泵将小柱中液体抽干,保持抽气2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱,洗脱液收集于15ml 玻璃试管中,于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl 乙腈-水(65:35) 涡旋溶解,静止15min 后,加入 10μl 0.2%盐酸溶液,混匀,供液相色谱测定。 2.5 测定 2.5.1 液相色谱条件 色谱柱:C18 柱(250mm ×4.6mm,5μm);预柱:C18 柱(12.5mm ×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(65:35);流速:1畅0ml/min;柱温:35℃;检测波长:292nm;进样量:40μl。 2.5.2 液相色谱测定 根据样液中3 种孕酮的含量情况,选定浓度相近的标准工作液,标准工作液和样液中3 种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下,标准品的色谱图见图1。 图1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图(100 ng/ml) 1 -醋酸甲地孕酮,2 -醋酸氯地孕酮,3 -醋酸美仑孕酮 3 结果与讨论 3.1 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在0.010 ~0.10μg/ml 范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系,其相关系数(γ2 )均大于0.998。 3.2 回收率、精密度和定量检测限 本实验以2 种脂肪(牛脂肪和猪脂肪)作为样本。取适量标准品加入到2.0g样品中,使添加量相当于10、20 和50μg/kg,每个添加水平各取24 份试样(每种脂肪各12 份)。图2 为空白脂肪样品和添加样品(10μg/kg)的色谱图。表1 为醋酸美仑孕酮,醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2 为8 家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验,能可靠测得的最低浓度确定定量检测限(LOQ),LOQ 为10μg/kg,满足残留限量的检测要求。 (A) (B) (C) (D) 图2 空白脂肪样品和添加样品(10(g/kg)的色谱图 A:牛脂肪空白样;B:猪脂肪空白样;C:牛脂肪添加样;D:猪脂肪添加样 PAGE - 1 -
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