高通量筛选方法诱导多能干细胞毒性实验-Molecular Devices Micro

www.MolecularDevices.com地址：上海市徐汇区宜山路1388号民润大厦8楼201103地址：香港九龙尖沙咀广东道33号中港城第6座16楼1605室 诱导多能干细胞毒性实验 药物引起的组织毒性是候选药物未能进入市场的一个重要原因，因此，安全性和有效性试验的高度预测分析是提高药物开发和降低候选药物抗药性的关键。人源诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝细胞和神经元，表现出成体细胞的典型特征和新陈代谢机制，是作为早期药物开发过程中高内涵筛选的理想选择。 虽然使用荧光和化学发光读板机检测标准细胞毒性实验已经众所周知，但是，如果使用细胞成像计数仪进行实际细胞观察会获得更多有用信息。 通过标准存活力实验获得更多信息 细胞存活力染料，如Calcein AM， 可以用来检测总化合物在活细胞中的毒性。Calcein AM只在表现出酯酶活性的活细胞内才会发出绿色荧光。iPSC来源的人肝细胞，首先加入不同化合物处理24小时，然后用Calcein AM染色；活细胞图像使用SpectraMax@ MiniMaxTM Imaging Cytom-eter获取(SpectraMax@ i3多功能检测平台的升级选项)。活细胞内的绿色胞浆区域使用SoftMax@ Pro软件内的细胞增殖分析模块进行鉴定(Figures1和2)，IC50值测定使用软件内的曲线拟合函数直接算出(Figure 3)。 Figure 1.存活力染料的活细胞检测 Figure 2.快速检测细胞增殖率 在肝细胞毒性实验中，通过热图数据结果可以快速显示哪种化合物具有细胞毒性。红色孔是细胞贴壁最多的，而蓝色孔则是贴壁最少的，图中可看出E-H排是细胞毒性最高的，A，M-P排则是无细胞的孔。 Figure 3.化合物IC50值由曲线拟合给出 Calcein AM染色的活细胞，使用SoftMax Pro软件内的细胞增殖分析模块进行鉴定，此分析采用计算活细胞覆盖面积占孔面积的百分比。右侧的紫色蒙图(masks)显示出活细胞的分布，可在左侧图片内观察到。 神经元的毒性体现在数量减少或神经突触的长度减少上(甚至存在于不影响细胞的数量或存活力的情况下)。通过成像实验不仅可以检测神经元细胞的主体，同时还可以检测神经元细胞的轴突和树突，提供了更多的细胞生长信息。 iPSC-神经元细胞以5，000 cells/孔种于384孔板，培养5天，然后加入按照1：2梯度稀释的视黄酸，四复孔排列，24小时处理，然后固定细胞，并使用AlexaFluor 488标记的微管蛋白抗体染色。 每个观察视野可以观测超过2000个细胞，接近30%的孔面积，然后使用SoftMax Pro软件内的细胞计数分析模块进行分析(Figure4)。 SpectraMax MiniMax 细胞成像系统可以提供细胞图像数据和细胞形态信息，可以补充读板机只有荧光强度的微孔板数据。其他如细胞计数、细胞密度等参数设置在评价化合物的iPSC肝细胞或神经元细胞毒性方面有着很高价值。 Figure 4. 视黄酸对于神经突增生的浓度依赖抑制效应 覆盖(%) 13.8 11.5 9.3 4.9 Top：随着视黄酸的浓度增加(从上往下，第一排为对照)，神经轴突的生长减少。紫色叠图(右列)为识别的细胞和神经轴突。 Right：根据浓度和叠图区域面积进行曲线拟合作图 ( 传 真：86-21-33721066 ) 传真：86-10-6410 8601 传真：886-2-2894 8267 ( 地址：北 京 市 朝 阳区永安东里16号C B D 国 际 大 厦901室10 0 022 地址 ： 台北市 内 湖区堤顶大道 二 段 8 9号 3 楼 ) 传真：852-31020004