近年来,中药慢性中毒问题受到人们的高度重视。中药雄黄在我国传统医学中有着悠久的历史,具有解毒杀虫,燥湿祛痰,截疟等功效。2010年版《中国药典》规定雄黄饮片中As2S2的含量应不低于90%,并对As2O3的量进行了限制。现代医学研究表明,雄黄在治疗白血病、癌症等恶性疾病方面也有不错的疗效。尽管雄黄具有这种独特的疗效,但由于其属于含砷矿物药,使其具有一定的毒性,而其毒性大小与砷的化学形态密切相关。Rana等报道了砷暴露可通过干扰抗氧化防御系统和减小SOD2 的基因表达,从而对肝、肾造成损伤。
北京化工大学理学院杜振霞、陈绍占,北京市疾病预防控制中心刘丽萍,中国医科大学公共卫生学院姜泓等人采用HPLC-ICP-MS联用技术建立了大鼠脏器中AsB、As(III)、MMA、DMA 和As(V)等砷形态的分析方法。
仪器与试剂:1200型高效液相色谱仪及7500a型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,美国Agilent公司);Dionex IonPac AS19阴离子交换柱(250mm×4mm,10μm);Milliplus 2150 超纯水处理系统(美国Millipore公司);数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)。(NH4)2CO3,NH3·H2O,H2O2(30%)、冰醋酸、NaCl均为优级纯;砷标准物质: 亚砷酸根离子[As(III)]、砷酸根离子[As(V)]、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(AsB),均购于中国计量科学研究院。超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。
质谱与色谱条件:ICP-MS条件: RF入射功率1450W,载气为高纯氩气,载气流速0.65L/min,辅助气流速0.45L/min,射频电压1.72V,采样深度7.8mm,泵速0.3r/s,检测同位素75As和35Cl。HPLC条件: Dionex IonPac AS 19阴离子分析柱;流动相: 20mmol/L(NH4)2CO3(pH=9.7);流速:1.2mL/min;柱温为室温;进样体积:25μL。
染毒方法:取4周龄Wistar大鼠4只,体重(50±10)g。分为低、中、高剂量组,给药剂量分别为0.3,0.9和2.7g/kg(以0.5% CMC为混悬介质),对照组给予0.5%CMC(羧甲基纤维素钠),雄黄染毒组灌胃给药,每天灌胃1次,连续6星期。染毒期间每3天称重1次,调节灌胃剂量。实验动物室温度(24±1)℃,相对湿度(50±5)%,每天12h光照,动物可自由摄食摄水。于末次给药2h 后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,取肝脏和肾脏。
样品前处理方法:称取0.3~0.4g(精确到0.001g)粉碎后的试样,加38mL水、2mL3%乙酸溶液,涡旋混匀后,60℃水浴超声2h,于4℃冰箱中静置5min后,取出,于4℃以9000r/min离心10min,上清液过0.2μm 滤膜。同时制备各试剂空白溶液。
1、方法的线性范围及检出限
分别配制了1.0,5.0,10,25,50,100,200和300μg/L的5种砷形态混合标准系列。在优化的实验条件下进行分析,1~300μg/L范围内,相关系数R2>0.999,结果如表1 所示。采用逐级稀释法,在0.3μg/L时,AsB,DMA 和As(III)的信噪比(S/N)大于3;在0.5μg/L 时,MMA、As(V)的信噪比(S/N)大于3。因此,确定AsB,DMA和As(III)的检出限为0.3μg/L,MMA 和As(V)的检出限为0.5μg/L。
2、方法的精密度及加标回收率
由于未发现同时存在5种砷形态化合物的样品,因此在雄黄染毒样品中分别加入3种质量浓度水平的5种砷形态混合标准溶液,制备成6个模拟样品,进行回收率和精密度实验,结果见表2。5种砷形态化合物的加标回收率在83.8%~111.7%之间,相对标准偏差RSD<5%。
表1 方法的线性范围与检出限
表2 方法的加标回收率与精密度
3、大鼠脏器中砷形态分析结果
采用优化好的条件对经雄黄染毒后的大鼠肝、肾样品进行砷形态分析。结果表明,经雄黄染毒后大鼠肝、肾中主要砷形态化合物为DMA、As(III)、MMA和3种未知砷形态化合物,依据出峰顺序命名为未知物1、未知物2和未知物3,测定结果见表3。
表3 大鼠脏器中砷形态
对肾脏样品3进行过氧化氢氧化实验,结果见图4。实验结果表明,As(III)氧化后全部转化成As(V);在AsB出峰位置检测到一种物质,氧化后消失,由于AsB不容易被氧化,推测为雄黄在大鼠肾脏中代谢的一种未知产物。未知物2和未知物3在过氧化氢氧化后也消失,同时发现,通过积分面积显示氧化后DMA和MMA的积分面积明显增大,由此推测这3种未知物氧化后生成了DMA、MMA或生成了与DMA、MMA出峰时间一致的物质。由于没用相应的标准品,未对未知物进行定性和定量分析,有待于进一步研究。
图4 肾脏样品3氧化前(a)和氧化后(b)的色谱图
建立的HPLC-ICP-MS方法适用于雄黄代谢后大鼠脏器中砷形态分析;雄黄代谢后大鼠肝脏中砷形态主要以DMA形式存在,存在少量的As(III)和未知物2;肾脏中的砷形态主要以DMA、MMA,As(III)、未知物1、未知物2和未知物3形式存在。