汞在自然界中以不同形态存在,最常见的形态有金属汞、硫化汞(朱砂矿石)、氯化汞和甲基汞。在鱼类产品中,甲基汞是主要的存在形态。美国环境保护署(EPA)汞的概述文件中提到,大多数成年鱼中90%到100%的汞是甲基汞(US EPA,2001)。
甲基汞对人类及动物的一些器官系统会产生不利影响已经被证实,包括神经系统(智障、耳聋、失明、口齿不清等)、肾脏系统、血液和心脏系统(血压、心率不齐和心脏疾病)。该化合物可以通过胎盘屏障和血-脑屏障,因此,在怀孕期间甲基汞的风险是主要关注的问题。其它影响还包括致癌性和基因变异。动物实验表明,甲基汞对免疫系统和生殖系统也有不利影响,是一个典型的致癌物。
大部分国家和组织现行标准为汞在鱼中的最大浓度为0.5毫克/公斤湿重。欧洲委员会(EC)已经推出了EC 1881/2006法规,规定了某些污染物在食品中的限值。至于水产品和鱼类中汞的含量,规则规定限值为0.5毫克/公斤湿重。
为了开展研究,有必要选择适当的方法测定鱼类中甲基汞浓度,该方法要具有良好的再现性、重复性,和好的准确度。珀金埃尔默所采用的方法是在酸性介质中用甲苯提取甲基汞,然后用L-半胱氨酸盐酸盐将萃取液反萃取到水相中,水提取物中的甲基汞含量采用HPLC-ICPMS分离测定。
ICP-MS工作条件
对于形态分析,HPLC分离洗脱后采用PerkinElmer®
ELAN®DRC-e型ICP-MS(PerkinElmer,Inc.,Shelton,CT,
USA)检测,ICP-MS工作条件和数据采集参数见表1。
色谱条件
高效液相色谱仪配有珀金埃尔默200系列泵, 自
动进样器,真空脱气机和柱温箱,所有分离在
室温下等度淋洗。分离柱是珀金埃尔默®C-18柱
(150mm×4.6mm×5μm),进样量为50μL,采用
200μLPEEK定量环。HPLC与ICP-MS通过自动切换阀直
接连接。最佳实验条件列于表2.
试剂
流动相制备:称取1克L-半胱氨酸溶解于1升去离子水
中得到0.1%(w/v)L-半胱氨酸溶液。
金洗涤液制备:500ppb的金洗涤液由1000ppm的金
储备液(珀金埃尔默)加去离子水制备,作为清洗液
在所有样品和标准之间注入。
标准制备
1克L-半胱氨酸盐酸盐溶于1L去离子水中制备成0.1%L-半胱氨酸盐酸盐标准空白,汞标准系列由1000ppm汞储备液(珀金埃尔默)制备,介质为0.1%L-半胱氨酸盐酸盐。称取适量氯化甲基汞(购买于Fluka公司)溶解于0.1%L-半胱氨酸盐酸盐溶液里制备成2000ppm储备液,加入适量的2-巯基乙醇(Sigma)助溶。甲基汞标准储备液先稀释制备10ppm标准使用中间液,在由标准使用中间液稀释制备成不同溶度的标准使用液,介质为0.1%L-半胱氨酸盐酸盐溶液。所有的标准都在4℃下避光保存,汞标准工作液随用随配,介质为0.1%L-半胱氨酸盐酸盐溶液。为了验证方法,使用龙虾肝胰脏(TORT-2)和角鲨肌肉(NRCC)两个标准参考物质作为测试样本。
样品制备
称取5g左右冷冻干燥的样品(图1)于50mL洁净的聚丙烯管(pp管)中,加入10mL甲苯,涡旋混合器搅拌5min,均匀地分散样品,确保所有甲基汞溶解于甲苯中。然后加入25克0.1%L-半胱氨酸盐酸盐反萃取溶液,振荡提取所有形态的汞于水相中。样品管在800rpm转速下离心3min,分离水相和甲苯有机相。用塑料注射器收集水相转移到另一个干净的聚丙烯管中在4000rpm转速下离心5分钟。塑料注射器连接聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器转移萃取溶液至HPLC样品瓶中,然后进样分析。
无机汞和有机汞在六分钟内可以完全分离。DORM-2 CRM的基体不影响色谱分离,SRM和标准的出峰时间一致。(澳大利亚国际研究会确认的参考物质 DORM-2中汞的形态。)
为了验证方法的稳定性,重复进样测定2ppb标准溶液,叠加色谱图如图3所示,证明了该方法的可重复性。
通过注入浓度的依次降低,直到三倍信噪比,确定该方法检测鱼样品中中汞含量检出限(LOD)为0.5ppb(μg/kg)。该方法的线性范围为0.5ppb至6ppb,相关系数(R2)>0.995。图4为校准曲线的色谱图,表明该方法有很宽的浓度范围。
为了验证HPLC-ICP-MS方法,测定TORT-2 和DORM-2两个参考物质中的汞化合物,同时在参考物质中加入4ppb汞和2ppb甲基汞,计算回收率。该方法汞的回收率误差为±10%,甲基汞的回收率误差为±20%(见表3)。
为了进一步验证方法对印度鲭鱼中甲基汞的提取效率,6个平行样提取前加入2ppb甲基汞,与未加标样相比较,计算回收率。鲭鱼399中未检出无机汞,甲基汞的浓度为0.4ppb。鲭鱼中甲基汞的加标回收率见表4,回收率误差在±20%之间。