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产品名称:人冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒Human Coronavirus(HCoV)
本产品是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的PCR试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物等组分经过优化,灵敏度高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据高度保守区设计,不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
人冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒Human Coronavirus(HCoV)操作过程:
一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
二、DNA提取:
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。
1、液体培养物:取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心3min,尽量吸弃上清,加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物:挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
人冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒Human Coronavirus(HCoV)样本采集、存放及运输:
1、样本采集:各类型样本按照常规方法采集;
2、运输及保存:低温运输,-20℃保存,保存期限一年。阳性对照需单独放置,不要污染其他试剂。
3、运输:采用泡沫箱加冰密封进行运输。
4、自备试剂:样品DNA。
盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 92℃ | 5 分钟 |
PCR反应30个循环 | 94℃ | 60秒 |
50℃ | 60秒 |
72℃ | 60秒 |
三、数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时,最大吸收光谱在 471 nm,结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm,最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理:
14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值,再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。
人冠状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒Human Coronavirus(HCoV)注意事项
1所有操作严格按照说明书进行;
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3反应液应避光保存;
4反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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