产品名称:内质网提取试剂盒(低速离心法)
产品规格:50T
高尔基体(Golgi apparatus, Golgi bodies)是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。又称高尔基器或高尔基复合体;高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。常分布于内质网与细胞膜之间,呈弓形或半球形,凸出的一面对着内质网称为形成面(forming face)或顺面(cis face)。凹进的一面对着质膜称为成熟面(mature face)或反面(trans face)。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡,在具有极性的细胞中,高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。因其看上极像滑面内质网,因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。 高尔基体中的酶主要有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等不同的类型。高尔基体的主要功能将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装,然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。
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内质网提取试剂盒(低速离心法),使用方法
1. 提取液制备:
将试剂A1和试剂A2混合,配成蛋白提取液A,充分混匀备用。
每500 μl蛋白提取液A中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用
2. 取5-10×106个以上细胞,在4℃,500×g条件下离心3-5分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 细胞样品中加入200μl-400μl冷的试剂 A,充分混匀。
5. 在2-8℃条件下振荡20-30分钟,至细胞充分裂解,细胞沉淀明显减少。
6. 在4℃,12000×g条件下离心5分钟。
7. 将上清吸入另一干净离心管,在37℃水浴5-10分钟。
8. 在37℃,1000×g力离心5分钟,此时溶液分为两层,下层是膜蛋白约为30-50μl。
9. 小心移除上层液体,收集上层部分留作备用分析。
10. 用150-200μl冰冷的试剂B充分溶解下层膜蛋白部分,混匀后冰浴2分钟,37℃水浴5-10分钟,37℃,1000×g力离心5分钟,此时溶液分为两层,下层是膜蛋白约为30-50μl。小心移除上层液体,保留下层。
11. 按以上步骤再次抽提下层膜蛋白(此步骤可以选做,一般不需要做)。
12. 用50-200μl冷的试剂C膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分,即得膜蛋白。
13. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
使用注意事项:
1旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
5 如果试剂盒不能短时间内用完,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
6 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
7下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测,提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂,注意提取过程保持低温操作,缩短离心时间。
内质网提取试剂盒(低速离心法),注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完!
保存温度2-8℃
保质期1年
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