T4 RNA连接酶1(T4 RNA Ligase1)催化3’→5’磷酸二酯键的形成,使核苷酸的5’-磷酸末端和3’-羟基末端连接,伴随着ATP水解为AMP和PPi。
应用
连接单链RNA和DNA
RNA 3’末端标记
RNA和DNA分子内和分子间连接
单位定义
• 1单位指在1×T4 RNA Ligase Buffer 中,37℃条件下,30分钟内将1nmol的5’-[32P]rA16转化为磷酸盐不溶物质所需要的酶量。
储存
-20°C可保存3年,避免反复冻融。
注意事项
(1)1× T4 RNA Ligase Buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.5,10 mM MgCl2,1 mM DTT。该酶反应时需要加入终浓度1 mM ATP。
(2)最佳反应温度37℃,65℃ 10min可使该酶失活。
(3)该酶的连接底物无论是ssDNA还是ssRNA均需要5’-磷酸化或预腺苷化。
(4)该酶不能连接双链DNA或RNA。
(5)加入终浓度20% PEG 8000或增加孵育时间可提高连接效率。
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