Gibson无缝克隆试剂盒

pUC57 Simple通用克隆载体采用了TOPO酶连接技术，载体预先偶联上TOPO酶，当加入PCR扩增产物后，5 min就可以完成连接反应，

Gibson无缝连接试剂盒是一种混合酶系统，其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多个PCR片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，可在30分钟内实现PCR片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置，从而获得完整的双链DNA分子。该试剂盒使用简单，只需加入合适比例的载体和PCR片段在室温孵育15-30min即可完成片段的连接。

优势

室温孵育即可完成片段的连接,无需50℃。

不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆

不依赖于T4连接酶，高效连接，无碱基缺失

可同时高效连接一个或多个PCR片段

无需额外的亚克隆，菌检阳性率高达95%

原理

T5外切酶可从双链DNA5'端切割形成3'突出末端， 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。

高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3'端延伸，从而填补片段缺口。

Taq DNA连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA分子。

储存

-20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反复冻融。

应用实例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果，可以看到检测反应<20min(达平台期)。

应用实例2： 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略，在反应结束后，倒置反应管，溶解管盖上染料后，阳性样本呈现出醒目的绿色，阴性表现出橙色，区分明显。且该方法不受样本类型限制，杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。

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应用实例3：采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2，结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性，而60℃条件下1min内酶活完全释放，恢复100%活性