线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒 可见分光光度法

线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：25T/12S、50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 工作液的配制：临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂 4℃可保存一周；

产品说明：

线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 4 ℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g 离心 15min。

3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4、 在沉淀中加入 200μL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅲ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入

三、复合体Ⅲ活力单位的计算

注意事项：

1、 尽量保持比色皿内反应液温度在 37℃或 25℃。可以在记录初始吸光度 A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放

入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录 2min时的吸光度。

2、 当测定吸光值大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后测定，计算公式中注意乘以稀释倍数。

3、 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

4、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。

5、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

6、 本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。

7、 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 50T/12S）

样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。

按样本质量计算：复合体Ⅲ（U/g 质量）=262×ΔA1÷W +52×ΔA2÷W

实验实例：

1. 取 0.1g 兔子肾脏进行样本处理，将复溶后的沉淀稀释 4 倍后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA=（A2 测定-A1测定）-（A2 对照-A1 对照）=（0.548-0.481）-（0.478-0.461）=0.05，按样本蛋白浓度计算得：

复合体Ⅲ（U/mg prot）=262×ΔA÷Cpr×4（稀释倍数）=262×0.05÷2.56×4（稀释倍数）=20.47 U/mg prot。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！