高尔基体膜蛋白提取试剂盒

产品概述

高尔基体膜蛋白提取试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的高尔基体膜蛋白的提取。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

保存温度

2-8℃

注意事项

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。

2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

一年

检测方法

WB,IP等

适用样本

动物细胞/组织

产品特点

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。

2.提取过程简单方便。

3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。

6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

产品应用

WB,IP等

仪器准备

1.离心机

2.振荡器

3.涡旋混匀器

4.移液器

5.冰箱

6.冰盒

试剂准备

1.PBS缓冲液

2.蛋白定量试剂盒

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

使用注意事项：

旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

最hao使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是高尔基体蛋白回收率会下降。

用Dounce匀浆器匀浆是高尔基体膜蛋白提取的关键的步骤，故匀浆前最hao先通过预实验确定不同组织样本的最适匀浆次数，方法是每匀浆 5-10 次后，取 2-3 μl 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到 20%以下为佳。此镜检步骤非必须步骤，但是会影响高尔基体膜蛋白的回收率。在样本极难获取的实验中，务必做镜检。

提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。

膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。

膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

使用方法

细胞高尔基体膜蛋白提取：

1. 提取液制备：

每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。

5. 用Dounce匀浆器匀浆充分匀浆。

6. 然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。

7. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

8. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。

9. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

10. 在4℃，10000×g力条件下离心10分钟。

11. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

12. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。

13. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B，混匀。

14. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。

15. 弃上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，充分混匀。

16. 在2-8℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。

17. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。

18. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。

19. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μl。

20. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。

21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高尔基体膜蛋白。

22. 将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

组织高尔基体膜蛋白提取：

1. 提取液制备：

每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2. 取50-100 mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。

3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。

4. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。

5. 用Dounce匀浆器充分匀浆30-40下，至无明显固体团块。

6. 然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。

7. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

8. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。

9. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

10. 在4℃，10000×g力条件下离心10分钟。

11. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。

12. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。

13. 在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。

14. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。

15. 弃上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，混匀。

16. 在4℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。

17. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。

18. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。

19. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μl。

20. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。

21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高尔基体膜蛋白。

22. 将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！