细胞免疫荧光检测服务的知识与应用及技术操作流程！

                 细胞免疫荧光检测服务的知识与应用及技术操作流程！

一、背景

细胞免疫荧光检测服务是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）是在免疫学、生物化学和荧光成像系统基础上建立起来的检测技术。技术原理是根据抗体-抗原特异结合，以荧光标记抗体示踪组织或细胞内相应抗原。免疫荧光技术因特异性强、灵敏度高和操作简便的优势广泛应用于免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等生物学和医学。

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显镜下呈现一种特异性荧光反应。

二、技术流程

1、细胞爬片：将细胞按20%-30%的汇合度接种到24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上。

2、细胞固定：4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3、细胞通透：Triton X-100通透20分钟，PBS洗三遍。

4、封闭：用与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5、一抗孵育：一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，PBS洗三遍。

6、二抗孵育：二抗室温孵育2小时或者37度1.5小时（避光），PBS洗三遍。

7、DAPI染核：在二抗孵育1小时后加入终浓度为100ng/ml的DAPI继续孵育。然后可在荧光显微镜下观察或直接封片保存。

8、甘油封片：在载玻片上滴一小滴甘油，小心地将细胞爬片从细胞培养板中取出来，种植有细胞的一面朝下轻轻的盖在甘油上，避免产生过气泡。4度孵育过夜晾干。

三、应用

细胞免疫荧光检测服务可用于循环肿瘤细胞检测：

外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多种恶性肿瘤中,其检测对于肿瘤早期诊断、预后分析、疗效检测以及个体化治疗等众多方面具有重要的临床意义,并因能够实时检测、创伤小等优点成为备受关注的“液态活检”。基于ISET原理,通过前期研究建立了改良ISET检测CTCs技术体系,主要工作基础包括：建立了改良ISET手工实验装置、改良了染色方法、提高了肿瘤细胞截留率,研究结果表明该技术体系检测效果较为理想,肿瘤细胞截留率可达80%以上,染色后的细胞形态学结构可辨,能区分典型的CTCs与正常白细胞。

联合细胞免疫荧光技术,建立ISET联合细胞免疫荧光检测循环肿瘤细胞技术体系,并通过检测23侈Ⅲ/Ⅳ期肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞进行临床预研究。通过对课题组前期ISET技术进行优化,联合细胞免疫荧光技术,建立了ISET-ICC检测CTCs技术体系。通过细胞蜡块-免疫组化技术体系,验证了ISET-ICC技术体系分离获得的CTCs性质,证实了EMT的存在。

通过与CellSearch、CTC-Biopsy两种CTCs检测方法对比,证实了ISET-ICC技术具有临床应用可行性,能够用于肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、肝癌患者的CTCs检测。ISET联合细胞免疫荧光技术能检测到上皮间质转化的循环肿瘤细胞以及循环肿瘤微栓,而这两种细胞是造成CellSearch假阴性的主要原因。ISET联合细胞免疫荧光技术能够辅助鉴定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。

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