pGRE-luc哺乳报告质粒

pGRE-luc哺乳报告质粒

基本信息

复制子: pUC

原核抗性: 氨苄青霉素Amp

筛选标记: 荧光素酶Luc

克隆菌株: 大肠杆菌DH5α

培养条件: 37℃

质粒简介

        载体 pGRE-Luc 可以用来检测 GRE 信号通路活性。载体 pGRE-Luc 含有萤火虫来源的荧光 素酶基因。这个载体也包含多拷贝的 GRE 结合位点序列，并且该序列和一段 TATA-类似启 动子（PTAL）融合在一起，PTAL 源于单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）启动子。当内源性 的 GRE 蛋白结合到 GRE 增强元件时，转录起始，报告基因开始表达。 荧光素酶编码序列后有一段 SV40 多聚腺苷酸信号以确保在真核细胞中能正确有效的转录。 在 GRE 结合位点的上游有一段合成的转录抑制区（TB），该区域由多聚腺苷酸信号与转录 终止位点组成，以减少转录背景。该载体骨架也包含了一个 f1 复制起始区域以便进行单链 DNA 的复制，一个 pUC 复制起始位点以及一个氨苄抗性基因，便于进行培养筛选。

        载体 pGRE-Luc 用来检测转录因子 GRE 与 GRE 增强子的作用，提供了直接检测这条通路活 性的途径。该载体可以和一个目的基因的表达载体共转来观察，其是否影响这条通路的活性。 荧光素酶是一种高敏感性的酶原性报告蛋白，适用于任何一种标准的荧光素酶检测法，可以 用来定量表达水平。pGRE-Luc 载体可以用任何一种标准的方法转染至哺乳动物细胞。为了 筛选稳定克隆，转染的载体通常含有抗性筛选基因如：neomycin，hygromycin 或者 puromycin。

       合适的宿主系：DH5α 以及一些其他通用系。进行单链 DNA 的合成宿主菌需要包含一个 F’ episome，比如 JM109。 筛选标记：质粒为宿主 E.coli 提供了氨苄抗性（100ug/ml） E.coli 复制起始位点：pUC 拷贝数：~500 不相容质粒:pMB1/ColE1。

质粒图谱

pGRE-luc哺乳报告质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pGRE-luc哺乳报告质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。