pRSFDuet-1大肠双表达质粒

pRSFDuet-1大肠双表达质粒

基本信息

启动子: T7/Lac

复制子: RSF ori

终止子: T7 terminator

质粒分类: 大肠系列质粒；大肠其它质粒；大肠双框质粒

质粒大小: 3829bp

质粒标签: N-6×His，C-S

原核抗性: 卡那青霉素Kan（50μg/ml）

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

表达宿主: BL21(DE3)等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物

5'测序引物: ACYCDuetUP1-F(GGATCTCGACGCTCTCCCT) DuetUP2-F( TTGTACACGGCCGCATAATC)

3'测序引物: DuetDOWN1-R( GATTATGCGGCCGTGTACAA) T7-ter-R( TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)

备注: 同时表达两个外源蛋白

质粒简介

         pRSFDuet-1质粒是一种原核表达载体， N端含有一个6×His标签，C端含有一个S标签。该质粒含有多个常用的酶切位点，便于不同基因克隆。表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导，目的基因被克隆到质粒载体上，受噬菌体强转录及翻译信号控制。

        该质粒还携带有RSF复制因子、lacI基因和氯霉素抗性基因。可以使这个pETDuet-1载体在一个适当的宿主菌株的coexpression 4目标基因插入MCS1的基因可以使用ACYCDuetUP1引物和DuetDOWN1引物进行测序。插入MCS2的基因可以用DuetUP2引物和T7进行排序。

        pRSFDuet-1 is designed for the coexpression of two target ORFs. The vector contains two multiple cloning sites (MCS), each of which is preceded by a T7lac promoter and ribosome binding site (rbs). The vector also carries the RSF1030-derived RSF replicon, lacI gene and kanamycin resistance gene (KnR). This vector can be used in combination with pACYCDuet™-1 , pCDFDuet™-1 , and pETDuet™-1  in an appropriate host strain for the coexpression of 4 to 8 target proteins. ORFs inserted into MCS1 can be sequenced using the ACYCDuetUP1 Primer and DuetDOWN1 Primer . ORFs inserted into MCS2 can be sequenced using the DuetUP2 Primer and T7 Terminator Primer . Unique sites are shown on the circle map.

质粒图谱

pRSFDuet-1大肠双表达质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pRSFDuet-1大肠双表达质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。