pCold II大肠表达质粒

pCold II大肠表达质粒

基本信息

启动子: CspA promoter

复制子: Ori,F1 ori

质粒分类: 大肠系列质粒；大肠表达质粒；pCold系列质粒

质粒大小: 4392bp

质粒标签: N-His

原核抗性: 氨苄青霉素Amp（100μg/ml）

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

表达宿主: BL21等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物

5'测序引物: pCold-F（ACGCCATATCGCCGAAAGG）

3'测序引物: pCold-R（GGCAGGGATCTTAGATTCTG）

备注: 冷休克蛋白表达载体

质粒简介

         当培养的大肠杆菌的温度充分降低，几乎暂时停止生长大部分的蛋白表达减少，而此时一组蛋白质称为“冷休克蛋白”被专门诱导表达。冷休克表达载体，pCold I-IV，是利用冷休克基因CSPA启动子设计高效率蛋白质表达载体。 CSPA的启动子的下游处，插入了lac操纵子，以便严格控制表达。此外，5'非翻译区（5'UTR），翻译增强元件（TEE），His标签序列，Xa因子切割位点和多克隆位点（MCS）位于在CSPA启动子的下游的。由于该产品采用了大肠杆菌的启动子，大多数大肠杆菌菌株可被用作表达宿主。有四种类型的 pCold载体，他们的下列原件的位置稍有不同，TEE，His标签序列和Factor XA酶切位点。

         pColdII质粒是利用冷休克基因CSPA启动子设计高效率蛋白质表达载体。在E.COLI启动子下游处，插入了lac操纵子，以便严格控制表达。此外，5’非翻译区（5’UTR），翻译增强元件（TEE）,His标签序列，Xa因子切割位点和多克隆位点（MCS）位于CAPS启动子的下游。当培养温度切换到低温时，大肠杆菌暂时停止生长，大部分的大肠杆菌蛋白质表达减少，但是一类称为冷休克蛋白的蛋白质被特异性诱导表达。

质粒图谱

pCold II大肠表达质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pCold II大肠表达质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。