pBR322大肠克隆质粒

pBR322大肠克隆质粒

基本信息

复制子: PBR322 ori

质粒分类: 大肠系列质粒；大肠克隆质粒；基因克隆质粒

质粒大小: 4361bp

原核抗性: 氨苄青霉素Amp（100μg/ml），四环素Tet（10μg/ml）

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

5'测序引物: PBR322.F（AAGTGCCACCTGACGTCTAA）

3'测序引物: PBR322.R (GCCTGCCACCATACCCAC )

备注: 应用很广的基因克隆质粒

质粒简介

        pBR322质粒相对分子质量较小，它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记。具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。

        pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。

        质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。

质粒图谱

pBR322大肠克隆质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pBR322大肠克隆质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。