5’RACE试剂盒

5’RACE试剂盒

英文名称：

运输：低温

保存：负20℃

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品及特点 

研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录起始位点，目前最通用的方

法是 5′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman

发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下，

利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 5′-端序列。本试剂盒

就是根据 5′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。

自备试剂 Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、B、C、75%乙醇。注意：自备的

基因专一性引物 A，B，C 的相对位置必须跟本手册产品介绍中的示意图一致。

运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法 1. 变性模板 RNA：将 1 μg mRNA 或 5 μg 总 RNA 加入到一个 RNase-free 的

塑料管中，补 RNase-Free 水到 10 μL，65℃保温 5 分钟后短暂离心，立即放

冰上待用。如果 RNA 浓度偏低，加 RNase-Free 水之前体积就已超过 10μL,

则需要使用本公司的核酸浓缩剂（需另购,编号为 110801）浓缩到所需的体积。

2. 在塑料管中按顺序加入：

成分 用量

自备的基因专一性引物A（10 μM） 2 μL

MMLV Buffer-dNTP混合液 6 μL

MMLV逆转录酶-RI混合液 2 μL

3. 37℃保温 60 分钟， 42℃保温 30 分钟， 50℃保温 10 分钟，最后 75℃保温

10 分钟使逆转录酶变性。短暂离心 5 秒后待用。

4. 在塑料管中加入 40μL 微量核酸沉淀剂（含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分

摇匀再取用），震荡混匀。

5. 室温 12000 rpm 离心 15 分钟，沉淀即为 cDNA。小心吸弃上清。此步沉淀可

以去除多余的 dNTP，否则它们会干扰下步的 TdT 加尾反应。

6. 加入 1mL 自备 75%乙醇，室温 12000 rpm 离心 5 分钟，小心吸弃上清。此

步可以洗去逆转录反应中的盐离子。

7. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，晾干后加入 20 μL RNase-free 水，充

分吹打溶解 cDNA 沉淀。注意：为保证加尾效率，溶解 cDNA 的 RNase-free

水最好不要超过 20 μL。

8. 在两个塑料离心管中按下表设置加尾反应：

成分 样品管 加尾阴性对照管

cDNA溶液（上步所得） 9 μL 9 μL

2×TdT Buffer（含dATP） 10 μL 10 μL

RNase-Free水 - 1 μL

TdT酶 1 μL -（用1μL水代）

9. 37℃保温 15 分钟进行加尾反应，然后 75℃保温 3 分钟灭活末端转移酶。

在反应管中分别加入 0.5 mL RNase-free 水稀释样品和阴性对照。此 250 倍稀

释液将作为下步 PCR 的模板。

10. 第一轮 PCR：按下表分别使用不同体积的样品稀释液和阴性对照稀释液做模板

设置 50uL 的 PCR 反应（单位：μL，下表只列出以样品稀释液为模板的反应）。

成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4

PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25

自备基因专一性引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5

5′ RACE 引物 A-引物 B 混合液 2.5 2.5 2.5 2.5

样品管稀释液 1 5 10 15

RNase-free 水 19 15 10 5

11. 按下列条件进行 PCR（注：应根据自备引物的 Tm 值选择适当的退火温度，下

面的参数仅仅供参考）。

第 1 次循环：94℃ 5 分，48-52℃ 2 分，72℃ 4 分

第 2-30 次循环：94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分

最后延伸：72℃ 15 分

12. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳（不需要上样液）检查 PCR 结果(样品

组 4 个样，阴性对照组 4 个样)。如果样品有一条清晰的扩增条带，而阴性对照

在相应的位置没有扩增产物，则可以不做后续的第二轮 PCR，直接进行 DNA

测序或切胶克隆。如样品没有一条清晰的扩增条带，则进入第二轮 PCR。

13. 第二轮 PCR：从 8 管 PCR 产物中各取 1μL 分别加入到 20 μL RNase-free 水

中进行稀释 20 倍，再各取 1 μL 分别作为第二轮 PCR 的模板，共 8 个反应：

成分 用量

第一轮 PCR 产物的 20 倍稀释液 1 μL

PCR MagicMix 3.0 25 μL

5′ RACE 引物 C 2.5 μL

自备基因专一性引物 C（10 μM） 2.5 μL

RNase-free 水 补至 50 μL

14. 按下列条件进行 PCR：第 1-30 次循环（94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3

分），最后延伸：72℃ 15 分

15. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳（不需要上样液），一般都会有一个样品

有清晰的条带出现，则可以直接进行 DNA 测序或 TA 克隆。