DNA嵌套缺失试剂盒
产品及特点本试剂盒用于以一段 DNA 为模板,利用 Exo III 外切酶的 3 到 5 外切活性,定向制 备该 DNA 片段的系列缺失。如果将此 DNA 片段克隆到适当的质粒中,则制备的 DNA 系列缺失可以转化,得到系列转化子,方便今后的后续分析。其原理示意图如下: 本产品具有下列特点:
1. 一站式,用户不需要单独购买各个成分并进行优化。
2. 定向,Exo III 外切酶只能从 5’突出的 DNA 末端对应的 3’端,或平末端 DNA 的 3’端往 5’端酶切,而从 3’突出的 DNA 末端进行酶切的活性则极低,故只要 DNA 片段同时具备上面两种末端结构,就可以控制 ExoIII 外切酶的酶切方向。 3
. 最长可处理 10kb 左右的 DNA 片段。
4. 本产品足够 10 次嵌套缺失实验(含 90 个取样点)。
5. 本产品只适用于科研,不能用于临床。
规格及成分 成 份 编 号 大扁盒包装
Exo III 外切酶(200U/uL) LM120420a 10 uL(红盖)
10×Exo III 外切酶缓冲液 LM120420b 100 uL(黄盖)
Mung Bean 核酸酶(40U/uL) 120408a 130 uL(绿盖)
10×Mung Bean 核酸酶缓冲液 120408b 1 mL(亮黄盖)
Klenow DNA 聚合酶(5U/uL) 131015a 40 uL(紫盖)
5×Klenow DNA 聚合酶缓冲液
(含的 NTP)
131015b 1 mL(白盖)
DNA 溶解液 1002 15 mL
上柱结合液 190602 30 mL
离心吸附柱(窄口) 170606 50 套×2
通用洗柱液 60408 100 mL
DNA 洗脱液 3.0 170603 10 mL
2×连接反应 Mix 100213b 250uL(本色盖)
使用手册 100213sc 1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 质粒 DNA、限制性内切酶、细菌转化试剂
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法
1. 将靶 DNA 片段克隆到任何一个克隆载体中,克隆位点一边必须有能产生 3’突出的 内切酶识别位点(此端不被酶切),另一边有能产生 5’突出或平末端的内切酶识别 位点(此端将被酶切)。注:产生 3’突出末端的内切酶有 KpnI、PstI、SphI、 Sse83871。产生 5’突出末端或平末端的内切酶有 AccI、BamHI、EcoRI、HincII、 HindIII、SalI、SmaI、XbaI、XmaI 等。由于 SacI 能在质粒上通过星号活性产生 切口,故好避免使用。ApaI、SacII 和 Sfi 产生的 3’突出末端可以被 Exo III 外 切酶酶切,故也不可用。
2. 制备高质量的质粒 DNA。注意:常规离心吸附柱方法制备的质粒 DNA 一般都有 nick (切口),Exo III 外切酶会以这些切口为切入点外切 DNA 片段,产生随机缺失,故 好采用氯化铯密度梯度离心法制备质粒 DNA。也可以用 DNA 连接酶将切口连接 上(具体需要参考 DNA 连接酶的使用手册,本产品不提供相关试剂)。
3. 用一个可产生 3’突出的内切酶和一个可产生 5’突出或平末端的内切酶将 5-10ug 质粒 DNA 线性化(反应体系不要超过 250uL)。好选用一种同时跟两种酶兼容的 酶反应液。相关操作参考限制性内切酶供应商提供的手册。本试剂盒不提供此步的 相关试剂。
4. 取少量酶切产物电泳检测酶切效果。注意:电泳时要用没有酶切的质粒 DNA 做对照。
5. 如果酶切成功,则在内切酶反应液中加入等体积的 DNA 溶解液和 2 倍体积的上柱结 合液(如果酶切体系为 250uL,则加入 250uL DNA 溶解液和 500uL 上柱结合液), 震荡混匀后全部转移到离心吸附柱中。
6. 室温放置 2 分钟后 13000g 离心 1 分钟。
7. 加入 0.7mL 通用洗柱液,13000g 离心半分钟。弃穿透液。 20190402dx
8. 再加入 0.3mL 通用洗柱液,13000g 离心半分钟。弃穿透液。
9. 13000g 离心半分钟。
10. 在离心吸附柱中加入 90uL DNA 洗脱液 3.0,室温放置 2 分钟。
11. 换新的收集管,13000g 离心半分钟,得到纯化的线性质粒 DNA。标记此管为 0 号。
12. 在 0 号管中加入 10uL 10×Exo III 外切酶缓冲液,吹打混匀放常温待用。
13. 标记 N 个离心管并在每个管中各加入 100uL 1×Mung Bean 核酸酶反应液放常温 待用。N 个离心管对应 N 个取样点,本试剂盒足够 90 个取样点。每次实验 N 设置 为多少取决于要缺失 DNA 片段的长度。一般每 300bp 需要一个取样点。如果要缺 失 2700bp,则需要 N=2700/300=9 个取样点。
14. 在 0 号管中迅速加入 1uL(200U)Exo III 外切酶,轻柔吹打混匀,立即放 37℃并 开始计时,1 分钟时迅速转移 10uL 到第 1 号装有 100uL 1×Mung Bean 反应液 的管中终止反应。第 2 分钟时迅速转移 10uL 到第 2 号装有 1×Mung Bean 反应 液的管中终止反应。依此类推,直到 N 个离心管都完成。注意:如果需要 DNA 缺 失长度间隔少于 300bp,也可以每半分钟取样一次。
15. 将 N 个离心管放 65℃5 分钟灭活 Exo III 外切酶,然后放常温短暂离心。
16. 在每管中加入 1.3 uL(约 50U)Mung Bean 核酸酶,轻柔吹打混匀,放 37℃保 温 30 分钟。此步将切除单链 DNA 区域。
17. 在每管中加入等体积(100uL)的 DNA 溶解液和 2 倍体积(200uL)的上柱结合 液,震荡混匀后全部转移到离心吸附柱中。
18. 重复第 6-第 9 步操作。
19. 在离心吸附柱中加入 40uL DNA 洗脱液 3.0,室温放置 2 分钟。
20. 换新离心管做收集管,13000g 离心半分钟,所得 N 个溶液即为纯化的嵌套缺失系 列 DNA 的不同时间点取样。
21. 在 N 个管中分别加入 10 uL 5×Klenow DNA 聚合酶缓冲液(含 dNTP)和 0.4 uL (2 U)Klenow DNA 聚合酶,轻柔吹打混匀,37℃保温 15 分钟以修平 DNA 末端。 22. 取 2.5uL 上步反应液,加到 2.5uL 2×连接液 Mix 中,16℃保温 1 小时。
23. 取 1uL 连接样品转化感受态细胞,制备质粒,筛选缺失长度合适的转化子。
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