人可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)ELISA试剂盒操作步骤

人可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)ELISA试剂盒
(用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

实验原理
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人sEPCR单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的sEPCR与单抗结合，加入生物素化的抗人sEPCR，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，sEPCR浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中sEPCR浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）
酶标板（CoatedWells）    96孔    酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）    12ml
10×标本稀释液（SampleBuffer）    12ml    20×浓缩洗涤液（WashBuffer）    50ml
标准品（Standards）：40ng/瓶    2瓶    底物工作液（TMBSolution）    12ml
第一抗体工作液（BiotinylatedAntibody）    12ml    终止液（StopSolution）    12ml

准备试剂与收集血样
1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清测定前用标本稀释液至少作1：20稀释（取10ul，加标本稀释液190ul,稀释20倍）。
2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成40ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入40ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序
1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应sEPCR含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能
1.灵敏度：最小的sEPCR检测浓度小于30pg/ml。
2.特异性：可同时检测重组或天然的人sEPCR。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3.重复性：板内、板见变异系数均小于10％。

注意事项
1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。
5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！