新技术能从一滴血中查出癌症

　　基于MALDI-TOF MS的具有划时代意义的创新抗体技术

　　株式会社岛津制作所田中最尖端研究所(所长：田中耕一，2002年诺贝尔化学奖得主;地址：京都市中京区)的佐藤孝明课题小组与美国同行Daniel J. Capon在基础技术开发取得了成功，他们共同研制出的抗体可将与抗原的结合能力提高一百倍以上。众所周知，抗体作为一种蛋白质，在生物疾病预防体系中的免疫反应方面具有十分重要的作用。而在蛋白质研究领域，一种叫做“钓钩”的新型技术已然开始使用，它可以从各种生化物质的血液、细胞中选取某种特定的生化物质，而且纯度极高。在使用质量分析仪器对蛋白质进行结构解析的时候，也可以在抗体中注入“钓钩”，以便提高其灵敏度。但是就目前的形势来看，在大部分注入“钓钩”的抗体所生成的生化物质、鼠•人嵌合抗体中，体现抗体模型结构而投入使用的Y字型蝶状连接(铰链)却几乎毫无自由度可言，可以捕捉抗原的位置乃是一个“点”，与抗原相结合的能力受到了极大的限制。本课题研究小组在抗体的铰链部插入了一个具备弹簧状结构的人工关节，它可以向抗原结合部提供“可变抗体”，使其自由度大幅度提高，并且确立了这种通过化学合成的抗体制作方法。通过以上操作，抗体与蛋白质、缩氨酸等抗原的结合能力可以提高一百倍以上，课题小组在全世界最先确认了此项研究成果。通过这项技术，“钓钩”功能有望大幅度提高，只要将“钓钩”前处理方法与最尖端质量分析仪器相结合，即可从一滴血中发现早期癌症以及各种与生活习惯相关疾病的早期症状，从而对诊断体系的构筑工程做出了划时代的贡献。不仅如此，它还可以作为抗体性药物(将抗体本身用于制药)来使用，有望在提高抗体性药物的功能方面发挥作用，这种动态最近颇受关注。本项研究成果，将于2011年11月11日(星期五)在日本科学院英文学术杂志《Proceedings of the Japan Academy, Series B》网络版上公开发表。

　　本项科研成果来源于下列课题：

　　最尖端研究开发支援(FIRST)计划/日本学术振兴会

　　课题名称：《为下一代MALDI-TOF MS、药品开发及诊断做出贡献》

　　核心研究人员：田中耕一

　　研究时间： 2010年3月-2014年3月

　　日本科学振兴机构(JST)作为研究支援主管部分，在该计划中发挥了应有的作用。

　　〈研究背景及经过〉

　　就世界范围来看，体外诊断药品市场规模如今已经达到每年2兆2000亿日元的水平，日本在市场占有率方面仅次于美国，大约为15%左右。其中，运用基因组学、蛋白质组学、代谢组学等“组学(Omics注释3))”的生物标志物分子诊断市场近年来始终以两位数的增长速度保持迅速发展之势。最近，以美国为中心大型制药企业，正在同时推进运用新型生物标志物的诊断器械体系以及新型药剂的研制工作。本项研究课题乃是最尖端研究开发支援(FIRST)计划中的一个课题，作为其中全球最高性能下一代MALDI-TOF MS开发中的一个环节，我们正在研究开发用于临床检体的蛋白质等结构分析所必须的前处理方法。而当务之急就是研制出从各类大量存在的分子中，特别挑选出那些使用抗体的微量目标分子“钓钩”(图一)，我们的计划是将下一代MALDI-TOF MS的全体灵敏度提高一万倍以上，这是一种具有重大革新意义的前处理方法。

　　但是，目前投入使用的抗体普遍注入了生化体衍生物、生化关联物质，绝大部分在结构方面多少发生了变化。在这种情况下，由于抗体的铰链部几乎毫无自由度可言，其抗原捕捉能力受到了极大限制。另外，在岛津制作所，有关部门已经在研制抗体磁珠设备注释5)以及质量分析仪器方面取得了成功。由于灵敏度依赖于目标分子的抗体结合能力，所以我们不打算墨守成规，而是希望开发一种具有划时代意义的试管内抗体合成法，以便获得具有更高灵敏度的抗体。

　　〈研究内容〉

　　在MALDI-TOF MS的帮助下，为了在生化试验材料中高灵敏度、高效率地检验出缩氨酸，具有革新意义的前处理方法的开发无疑至关重要例如，为了对生化试验材料中的目标肽进行浓缩，目前有一种使用单克隆抗体注释6)的浓缩提纯法可供借鉴，其特点就是可以锁定磷酸化肽。另外，我们已经开发出了诸多具有更加定量解析功能的方法，诸如可以使用稳定同位素注释7)来发现蛋白质并对其进行鉴别，还有差异性解析(对每个样本进行数据解析)等等。而在这项课题研究中，我们将缩氨酸作为相当于(Y字型“V”部分)化学合成β-淀粉样注释8)的Fab抗体领域来加以使用，在它与由动物细胞生成的Fc领域(Y字型“I”部分)之间，注入了一个相当于人工关节功能、具有蝶状结构的非缩氨酸连接部(相当于铰链部)，以便令其在试管中相结合。合成后的“β-淀粉样非缩氨酸连接部/由动物细胞生成的Fc领域”就是所谓的合成化合物，使用质量分析仪器(MALDI-TOF MS注释9))即可对其结果进行确认。而且还可以对抗体是否具备“Fab领域/铰链部/Fc领域”这种三结合抗体的化学结构予以确认。随后，我们运用表面等离子共振技术注释10)对与β-淀粉样进行特异集合的单克隆抗体结合部分进行查看，结果判明其结合能力取得了飞速增长(100倍以上)。通过增加铰链部的自由度，可以在更加广阔的“面”上捕捉抗原，从而使捕捉功率得以飞速提高。也就是说，我们以“抗体的铰链部替换为非缩氨酸连接”作为手段，在全世界第一次成功地将抗体Fab领域/改变为具有伸张性以及高度弹性的“可变抗体”(图二所示)。另外，其化学结构可以凭借质量分析仪器(MALDI-TOF-MS)得到明确的评估。

　　〈今后的发展计划〉

　　本项研究成果，将来可以凭借使用新型“可变抗体”的前处理方法以及最尖端质量分析仪器的技术组合，从一滴血中即可发现早期癌症以及各种与生活习惯相关疾病的早期症状，从而对诊断体系的构筑工程做出划时代的贡献。而且还可以作为抗体性药物(将抗体本身用于制药)来加以使用，有望在飞速提高抗体性药物的功能方面发挥作用，这种动态最近颇受关注。

　　参考图

　　抗体与抗原之间的关系如图例“钓钩”所示。也就是说，为了在数众多的鱼群(蛋白质等化合物)中钓到目标的鱼(抗原)，就必须使用特制的钓钩及鱼饵(抗原)。

　　图一： “钓钩”概念图

　　已知抗体(左侧)由于在铰链部几乎毫无自由度可言，捕捉抗原惟有通过“点”来作业。与此相对比，“可变抗体”(右侧)通过在铰链部插入了一个蝶状人工关节，能够以铰链部为顶点进行旋转运动(或伸缩运动)，捕捉抗原可以在“面”上进行(立体)作业，因此捕捉效率得以飞速上升。

　　图二 已知抗体与本课题研制成功的“可变抗体”之间的差异

　　术语解释：

　　注释1) 质量分析仪器

　　从试验材料中选出类似化合物并将其离子化，对其进行分离、检测、测定、数据解析的仪器。

　　注释2) 嵌合抗体

　　将人类抗体的可变部(接近Fab领域的前端的那一半)嵌入从老鼠身上提取的抗体。

　　注释3) “组学”的词尾

　　基因组学(遗传基因解析)、蛋白质组学(蛋白质解析)、糖组学(糖基化解析)。代谢组学(细胞代谢解析)等的总称。

　　注释4) 生物标志物

　　通过对血液、尿液中的蛋白质等物质进行检测来掌握疾病存在与否以及进展状况的指标，又称生物标记物。

　　注释5)抗体磁珠

　　使抗体在磁珠(微粒子)表面进行结合、固化后的产物。利用目标分子与抗体结合后的抗体磁珠的特征(重力及磁力)，使它在离心力作用下下沉，再通过磁力的吸引作用，可以使目标分子高效率地聚集起来。

　　注释6)单克隆抗体

　　由单一克隆细胞集群所产生、结构单一的抗体。

　　注释7)稳定同位素

　　在物质的构成元素中虽然原子序数相同，但是“原子质量不同”，这些原子被称为同位素，其中半衰期基本保持不变的元素叫做稳定同位素。

　　注释8)β-淀粉样

　　它是蛋白质当中的一种，如若在脑内大量堆积就会形成凝块，我们通常称之为“老人斑”。

　　由于在阿尔茨海默症患者的脑部发现大量老人斑形成，所以目前医界普遍认为其病因乃是蛋白质。

　　注释9)质量分析仪器(MALDI-TOF MS)

　　将基质辅助激光解吸电离技术(MALDI：Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

　　与飞行时间质谱(TOF-MS：Time Of Flight Mass Spectrometry)相结合，对质量进行分析的仪器。MALDI如今已然成为生化高分子电离化的主要方法，其实就是本项最尖端开发支援计划中核心研究者(田中耕一)所发明的软电离质谱技术(荣获2002年度诺贝尔化学奖)的新发展。

　　注释10)表面等离子共振技术 (Surface Plasmon Resonance ：SPR)

　　金属中电子与光会产生相互作用的现象。由于表面等离子会发生共振，所以表面上只要有极少量分子结合在一起，共振状态就会敏感地发生变化。我们将这种检验原理应用于生物感应器，它的灵敏度极高，可以对微量蛋白质进行检验。

　　论文名称

　　《Flexible Antibodies with Nonprotein Hinges》　《非蛋白质铰链部的可变抗体》