回复chaifayong发表于:2020/4/18 12:27:37悬赏金额:
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未解决
前提是我懂紫外分光光度法,不懂树脂的替代度是怎么回事,至少现在还是模糊的。
树脂是用来固相合成多肽用的,替代度可能是上面有多少个反应点?
我们这用一种叫“王树脂”的东西。检测步骤是:
1、首先将一种叫“Fmoc-Leu-OH”的氨基酸接到树脂上,用到好多试剂。
(1)称取1g树脂,用4ml左右的DMF使其膨胀,约放置30分钟时间;
(2)加入计算当量的Fmoc-Leu-OH、HOBt-Cl、DIC、DMAP,室温振荡15小时以上,(溶液是浅棕红色)。
(3)分别用DMF3*10ml、MeOH3*10ml、DCM5*10ml冲洗。洗后树脂在室温下减压干燥4小时以上。
2、用Fmoc-Leu-OH为对照,称取10mg左右,用20%哌啶的DMF溶液溶解,定容于10ml量瓶中;平行将干燥后的树脂称取3份,0.1g左右,同样用20%哌啶的DMF溶液溶解,定容于10ml量瓶中。以上4瓶超声30分钟。
3、放置,使树脂沉降,(Fmoc-Leu-OH已经溶解),取比色皿加入2.7ml甲醇作为空白,以对照溶液50ul、70ul、90ul、110ul、130ul分别加入到比色皿中,在300nm下测吸光度,制定测量曲线。
3.*特别说明:我第一次做,在测对照溶液时,是平行取2皿,各加2.7ml甲醇,1作为空白,另一分别加50ul,后各加20ul连续测吸光度。
4、同样以2.7ml甲醇为空白,测样品溶液的吸光度。
我的问题是:
1、为什么单以甲醇为空白,溶液中也含有哌啶和DMF,这2者没有紫外吸收吗?
2、溶液与甲醇的混合,是用枪头管不断吸排混匀的,以前没有这样做过,生化实验可能这样做的比较多?
3、对照溶液各溶液体积不一样,虽然差异不大,并且R值也在4个9以上,但这样做是否合适?
4、对照只做1份,可以吗?
5、为什么用Fmoc-Leu-OH,其他的Fmoc氨基酸不行吗?
6、最重要的问题,反应原理是什么?为什么选300nm?步骤1中(2)下各种试剂的作用是什么?用三种溶剂去洗,洗什么?
整体糊涂中,求帮助!!!谢谢了!