回复zidingxianghua发表于：2013/8/4 20:23:22悬赏金额：
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已解决
做一个甾体皂苷的含量测定，已经做第4次了，问题始终没解决，遂请教。
具体要求如下：
色谱条件要求：
C8的柱子；流动相是乙腈-水（30:70）；检测波长210nm。
样品处理：
取一定量，加75%乙醇超声10分钟，放冷，补足减失重量，滤过，即可。
对照品也是用75%乙醇溶解。
测试经过如下：
有同一厂家同一品种不同批号两批样品，用C8的柱子做，计算了下，含量合格，但峰实在太难看。怕峰形太差影响结果的准确性，但只有一根这C8的柱子，只好换根C18的柱子，调整流动相试试；峰形很好，进了一针其中一批的样品，计算了也合格，就编个序列继续做下去了。
第四天才发现另一批不合格，只好第五天返工。
第二次，问题出现了。
返工时，同样的仪器，色谱柱，色谱条件，用原来配的对照品溶液，重新处理样品，不合格的那一批还是不合格，结果比上次测的还低一点，合格的那批也不合格了。
又另配了对照品溶液，与之前配的浓度相差不大，但峰面积小多了。但是之前配的对照品峰面积反而变大了，估计是因为流动相微调，把之前没分开的小峰分开了，不至于斜着积分的原因吧。
怀疑过对照品峰面积小，是不是冷冻（对照品要求冷冻保存哈）后没放至室温，直接称，导致称不准。
样品怀疑过的原因 A:是不是不合格那一批取样量大了，浓度高了，导致过饱和，未全溶 B：样品是不是未混匀，取样代表性不够 C：超声时间，功率是不是有问题，是不是超声发热导致样品降解（对照品要冷冻保存嘛）E：是不是第二次配的溶样溶剂有问题
第三次做，更蹊跷了。
之前怀疑的样品的原因都排除了。减少，增加取样量；混匀样品；超声不同时间，用不同超声设备（不同功率）；超声中换水，防止温度升高，水浴上回流处理样品；重配75%乙醇几次，用无水乙醇配也试了，还换用甲醇，样品溶液居然都没有目标峰。但之前两次配的对照品溶液峰高变化不大，高的还是高，低的还是低。
第四次，就是今天。又重配了对照品溶液，换甲醇（色谱纯）溶解，居然对照品也没峰了，用75%乙醇溶解也是。之前配的对照品峰高还是老样子。将第一次配的对照品溶液跟这次提取的测不到目标峰的样品溶液混合，也能出目标峰。
这根柱子换走另一个对照品测试，峰好得很。再换另一根柱，走样品和对照品，还是老样子，之前能出的还出，出不了的还是还是出不了。
总结：一共配了三次对照品，浓度差异不大，但峰面积在变小，第三次就没了。
样品也是，第一次合格的，第二次提取也不合格了，以后干脆目标峰也不出了。
分析：应该不是目标物不稳定的原因，因为第一次配的对照品，隔了一周，峰高依然变化不大，更何况新配的对照品溶液。
几次都是我操作，对照品溶液都超声助溶过，应该也是溶了的。而且用紫外扫过，稀释后吸收值会降低，虽然最大吸收波长在约205nm。其实用甲醇比用75%乙醇溶解要好些，几乎振摇就能溶，用75%乙醇必须稍超声一下。
色谱柱应该也没问题，因为第一、二次配的对照品能出峰，而且稳定，进几针试了，保留时间和峰面积的RSD值都在允许范围。虽然第二次比第一次小得多。而且换了柱子也是一样的情况。
现在不说提取方法有没有问题，连对照品都不出峰了啊。
到底是啥原因呢？从来没有遇到过啊。恳请各位亲帮助指点啊，实在是没办法了，该想的都想到了，还是不行。
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