回复threetigers107发表于:2020/9/18 22:00:49悬赏金额:
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未解决
如题,用CE-SDS方法分析单抗,做了一段时间,也有了一些数据,但不知道该怎样准确理解这些数据。
首先Becman提供的一个文献里(见附件),作者测了一个已知NG(non-glycosilation)含量为9%的IgG,分别在reduced和Non-reduced条件下测定。结果是,两个条件下测出的NG含量基本一致,接近理论值,并且重链和轻链的比例也是接近2.
而我现在做的那个抗体,在reduced条件下和在non-reduced条件下测得的NG含量差异较大,reduced条件下的要明显低于non-reduced的。并且重链和轻链的比值不是接近2,而是2.5。我用PNG酶切过之后,NG出峰位置含量明显增加。另外我还做了几个stressed的样品,比如双氧水氧化的,比较明显的是在Intact-mAb(non-reduced条件)和重链前(reduced)出现很大的峰。
下面是几个问题:
1. 理论上,reduced条件下测得的NG含量应该是和Non-reduced条件下测得的接近(同文献)还是说其实这是CASE BY CASE的?因为是和UV吸收有关,如果几个有紫外吸收的氨基酸在轻重链上的分布不均衡,比如在轻链上更多,那轻链的响应值就会比较高,这样轻重链的比值就不是简单的1:2了。而NG的含量在两个条件下也就不一定相关了。
2、双氧水处理之后产生了Mw不一样的峰,可能是什么东西,是破坏了什么键产生的?
3.为什么单抗的CE-SDS分析通常都做还原和非还原的条件,二者所得的数据是怎样互补的?
谢谢大家的答疑解惑,欢迎交流!
补充一个疑问,是关于还原和非还原条件的。还原条件用的是巯基乙醇,打开二硫键;非还原条件用的是250mM的碘乙酰胺。我经常在文献上看到是这么说的:还原时先用巯基乙醇打开二硫键,然后再加烷化剂碘乙酰胺保护已生成的巯基,避免重新生成二硫键。然后我就很纳闷,那为什么再做CE-SDS的时候,还原时用了巯基乙醇后不再加烷化剂保护巯基,而非还原的时候为什么要加碘乙酰胺,是要保护单抗中的游离巯基么(没理由啊??)