最近又发展了毛细电泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并应用激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)检测器提高灵敏度。此外，同生化检测法相比，CE易于实现自动化，避免了放射性物质。TLC也是有效的毒素监测手段，易于操作，不需特殊设备，监测限度可达ng级，但在监测的灵敏度方面要逊色于HPLC。
5.3 细胞毒性检测技术
细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来监测毒素的一种技术，不仅可以判断毒素存在与否，而且可以对毒素进行精确的定量。这种方法监测的也是能发挥相同毒性作用的毒素的总量。
Fladmark等建立了一种根据MC导致鲑鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定MC的方法。他们将分离的鲑鱼或大鼠的肝细胞悬浮培养，然后加入MC，根据细胞凋亡的程度即可求出MC的含量，监测限度为10～20ng。
动物细胞凋亡的第一个信号是发生凋亡的细胞与邻近的细胞分离。根据这一特性，Fladmark等还建立了用MC导致悬浮培养的鲑鱼或大鼠肝细胞解聚的程度来监测毒素的方法，所得结果比用判断细胞凋亡的程度所得结果灵敏5～10倍。
5.4 酶活性抑制检测技术
由于MC等能够抑制PP1和PP2A的活性，因此可以通过对酶活性的抑制程度来监测这几种毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制检测(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技术以来，这种技术得到了迅速发展。PPIA多数以32P标记的糖原磷酸化酶a为底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反应后根据PP水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量就可计算出毒素的量。一般用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，用MC-LR的量来代表总毒素的量。随着对硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解现象的发现，人们建立了一种以pNPP为底物的磷酸酶抑制比色监测技术，根据pNPP被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的量。PPIA的监测限度为pg级，它监测的是能抑制PP的总毒素的量，而不是某一种毒素的量。但蓝藻本身具有的内源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的结果偏低。
5.5 免疫检测
毒素的免疫监测技术的原理是利用毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行监测。
最早的免疫检测是免疫化学技术中最有效的一种分析方法，1960年由Yalow和Berson开创的，用于检测血液中的胰岛素。从此，免疫检测广泛应用于医药化学分析领域，检测激素、药品、病毒等。免疫检测操作非常简单，但是在环境污染物检测分析中的实际应用却非常少。
免疫检测的基础是抗原抗体之间的反应。它是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。抗体是一种免疫球蛋白，它是动物机体对外来物质（抗原）发生反应而产生的。抗体可以和抗原物质形成抗原-抗体复合物。在免疫化学分析方法中，未反应的抗原和抗体被称作自由相，抗原-抗体复合物被称作结合相。抗原和抗体之间的反应具有特异性，并且非常灵敏。这些特性对于动物机体防御疾病和免疫检测都非常重要。随着样品检测费用的不断提高和检测项目的不断增加，发展了免疫化学检测方法；另一方面，对快速、简单的原位检测的需求，也促进了免疫检测的发展。免疫检测可以广泛地用于检测许多不同的化合物。
自80年代开始，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)开始用于MC的监测。水质免疫检测中最常用的检测方法是竞争性非匀相酶联免疫检测。在这个检测方法通常将抗体包被在96孔板（聚苯乙烯微量滴定板）的微孔底部，或者其他固定相上。把酶标记在已知浓度半抗原上，以便产生可以检测的信号。在待测半抗原和已知浓度的酶标记和抗体形成复合物之后，将剩余的试剂洗脱，加入酶的底物，产生显色反应。根据颜色的深浅，定量抗原，或者根据是否显色，判别样品中是否有分析物存在。
Chu等人首先提出了应用ELISA监测MC的完整程序，他们将MC-LR与牛血清蛋白偶联，用得到的偶联物免疫兔制备兔抗MC-LR多克隆抗体(PAb)，然后将MC-LR与辣根过氧化物酶偶联，以邻苯二胺(OPD)为底物用直接竞争法做ELISA。用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，根据底物的显色程度与标准曲线作比较即可求出毒素的含量，监测限度为0.20μg/L。他们发现抗MC-LR PAb与MC-LR，-RR，-YR有较好的交叉反应性，但与MC-LY，-LA的交叉反应性低。An和Carmichael证实了Chu等的观点，并提出C-6上为E-型的Adda和Arg对毒素的抗原性是必需的。McDermott等用从鸡蛋黄中提取的抗MC-LR PAb做ELISA监测毒素，发现监测限度为95ng/L。这种方法制备的抗体产量大，方法简便，而且对MC-LR和-RR有良好的交叉反应性。尽管抗MC的单克隆抗体(MAb)很早就已制备，但直到1995年才由Nagata等建立起一整套完整的ELISA监测技术，其监测限度为25ng/L。最近，他们又制备了能够特异性的识别抗MC-MAb和MC形成的免疫复合体(immune complex)但不与MC或抗MC MAb反应的单克隆抗体，并建立了一种三明治监测技术，监测限度为2ng/L。目前已有针对MC的ELISA试剂盒可以买到，这大大方便了毒素的监测工作。但目前的试验表明抗体往往只是针对某一种毒素建立起来的，对某些毒素的交叉反应性低，不能监测所有的毒素。有研究表明，将分别针对某一种毒素做ELISA所得结果加起来后与用小鼠法所得结果有很好的一致性。
酶联免疫法由于具有灵敏、快速、简单、便携、易用、适用现场分析等特点，显示出良好的发展趋势。
常规的理化检测仪器，特别是
液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）和
气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪器体积庞大、价格昂贵、需要环境条件较高的室内环境、而且还需要专门的技术人员操作，因此检测费用居高不下（＄40-200/样品）；磷酸酶抑制试验和细胞试验虽然都能很好地检测出毒素，但是灵敏度太低，甚至不能有效地检测出WHO推荐的1mg/L；同时，环境监测的项目、样品数量不断增多，检测限不断提高。免疫分析是基于抗原-抗体特异性反应的分析方法，检测灵敏度高、特异性强、分析容量大、反应速度快、检测费用低廉（＄5-10/样品）。因此，免疫分析技术受到了各国的重视。美国、德国在80年代末开始研究免疫检测方法，世界粮农组织（FAO）已经相许多国家推荐这项技术。因而开发和利用免疫检测技术是有前景的，美国国家环保局（EPA）目前推行的几种用于检测环境中microcystins的方法按先后顺序依次为：
• Immunoassay
• Bioassay
• Protein phosphatase assay
• HPLC
• LC/MS
由于微量蓝藻毒素对人类危害严重，迫切需要对水体中特别是做为饮水水源的湖泊、河流和水库中的蓝藻毒素进行连续监测。上面提到的监测技术是针对分布广、毒性大的微囊藻毒素建立的，这些监测技术各有其优点和缺点，对比如表2所示。
表2 微囊藻毒素监测技术的优缺点
监测技术1) 优点 缺点
小鼠法 毒素的有害效应易检测到 不能区分微囊藻毒素的异构体
操作简单 工作量大；伦理问题
HPLC 对不同毒素可进行定性和定量 毒素需预处理；灵敏度较低
设备庞大、昂贵；需专业人员
ELISA 可检测到毒素的不同同系物 对多种同系物的识别需要广谱抗体；商品化的试剂盒可靠性需进一步检验；标准不统一
商品试剂盒的出现大大方便了操作
高灵敏度
PPIA(放射标记或显色) 只监测PP1和PP2A的抑制剂 测定毒素总量，不能区分特异的毒素同系物
高灵敏度 需要新制备的放射性底物；放射性废物的处理困难
细胞毒性监测 用原代肝细胞可获得高灵敏度 原代肝细胞的生产工作量大
用建立的细胞系可方便实验 建立的细胞系往往灵敏度较低
1)HPLC：高效
液相色谱；ELASE：酶联免疫吸附测定；PPIA：蛋白磷酸酶抑制测定；PP：蛋白磷酸酶。
sjb150 回复于：2007/12/8 11:02:02
您现在的位置：
