中药DNA指纹图谱技术


一、溯流求源——追踪指纹图谱

每个人的指纹都是各不相同的，根据指纹的不同，可以将不同的人区别开来。如果能从不同种属的中药材中找出代表其自身特征的指纹，那么，就可以象鉴别人类的指纹一样，将不同种属的中药材区别开来。怎样去寻找中药材的特征指纹呢？或者说怎样的指纹才能代表中药材自身本质的特征呢？

绝大多数的中药材都是植物体、动物体和菌物体，而一切生命体都可以从基因水平或者说DNA水平上进行刻划，因此，最能从本质上表征中药材自身特征的就是DNA分子水平上的指纹。

十个手指非一般齐，这种现象说明十指的长度不同，也就是具有长度多态性。最早的DNA指纹研究始于二十世纪八十年代初期，是一种称作限制性片段长度多态性（英文缩写RFLP）的技术。在细胞中有一种特殊的酶——限制性核酸内切酶，它可以把DNA切割成长度不同的片段。这种酶有一个特点，就是它只能在DNA的特定位点上进行切割，而且，只能识别这些特异的位点。在长期的进化过程中，不同种属的生物体中DNA上的这些限制性核酸内切酶的切割位点是各不相同的，因此，当用一种限制性核酸内切酶对某种生物体DNA进行切割时，就会产生一系列长度不同的酶切片段，形成该种生物特异的DNA指纹图谱，这种指纹图谱就叫做RFLP图谱。不同种生物的RFLP图谱是不同的，根据RFLP图谱就可以进行中药材的品种鉴定。

DNA是由四种不同的脱氧核苷酸相互连接而成的双螺旋长链。在DNA中的许多部位上是由几个或几十个核苷酸序列片段重复串联而成的，这些部位的DNA就叫做微小卫星DNA。不同种生物的串联重复序列的位置是不同的，而且，串联重复的长度也是不同的。根据这些差异，1985年，英国科学家杰佛雷斯（Jeffreys）利用人类微小卫星区的DNA进行了生物个体与种属的鉴别，并首次把这一技术称之为DNA指纹图谱技术。

也是在1985年，美国科学家穆里斯（Mullis）发明了一种称之为聚合酶链式反应（PCR）的技术。这种技术是先人工合成一对几个至十几个核苷酸长的寡核苷酸引物，利用这对引物和DNA聚合酶，在有四种脱氧单核苷酸存在的条件下，就可以将要扩增的DN***段进行指数倍地扩增，而这一切只在试管中就可以完成。由于这项技术对生命科学与技术具有划时代的影响，穆里斯于1993年荣获了该年度的诺贝尔化学奖。

在PCR技术的基础上，1990年，威利姆斯（Williams）发明了另一种新的DNA指纹图谱技术——随机扩增多态性DNA（英文缩写RAPD）技术。与PCR技术中合成一对引物不同的是，在RAPD技术中，是合成一系列9——10个核苷酸长的核苷酸排列顺序随机的单链引物，然后，用这些引物对基因组DNA进行PCR扩增。由于不同种属生物可扩增出的DN***段与长度的不同，就可以形成代表这种生物自身特征的指纹图谱，从而可以进行生物物种的鉴定。

利用DNA指纹图谱技术进行中药材品种鉴定始于1990年代，目前主要采用的技术是RAPD、RFLP和在PCR基础上的DNA测序技术等。

二、大显身手——辨别中药真伪

从距今大约六千五百万年前的被地质学家们称之为新生代第三纪的时候开始，地球气候发生了重大的变化，海水退却，气候变冷。曾经统治地球达上亿年之久的恐龙也早已退出了历史的舞台，可陆地上，被子植物却繁盛了起来。在荫凉的林下小气候中，催生出了一种对后世影响极为深远的多年生草本植物——人参。自人类发现了人参的滋补强壮等多种药理功效之后，人参已几乎成为妇孺皆知的保健珍品。尤其是随着科技的进步，从二十世纪中叶开始，人们已能大规模地进行人参的人工栽培，从而使其真正地从昔日的皇室贡品，走进了寻常百姓的门户。然而，在人们的传统观念中，野生人参仍然比栽培人参具有更高的地位。一棵五年以上生的野山参可以卖到几千乃至十几万元，于是，野山参的伪品也就应运而生。如何从基因水平上辨别野山参与栽培参的真伪呢？

科学家们采用RAPD技术，设计了80个随机引物，用这些引物分别对野山参和栽培人参进行DNA扩增，结果发现其中的一个引物可以扩增出野山参DNA的特征指纹，利用这条指纹就可以将野山参与栽培参区别开来。

把一小块肥皂溶解于一杯清水中，用力振荡水杯，会出现许多肥皂的泡沫。如果把人参的有效成份溶解在同样的一杯清水中，振荡后，也会产生许多类似的泡沫，因此，人参的这种有效成份就被称作人参皂甙。皂甙是由一个多糖分子和一个甙元分子组成的，而这甙元分子也叫作配糖体。

西洋参产自北美，故曰“西洋”，与人参相似，其有效成份也是以四环三萜皂甙为主。西洋参与人参不仅总皂甙含量相似，而且，二者所含的单体皂甙及甙元的类别也相同，因此，西洋参也被用作人参的代用品。不过，产地毕竟不同，地理上的隔离，必然会造成基因水平上的些微差异。中医认为：人参性温，而西洋参则性寒。现代药理学研究发现：人参中三醇型人参皂甙Rg的含量高于西洋参中Rg的含量；人参中二醇型人参皂甙Rb的含量低于西洋参中Rb的含量。已知三醇型人参皂甙的生理活性高于二醇型人参皂甙，Rg1具有兴奋中枢神经、抗疲劳和升高体温的作用，而Rb1则具有精神安定、解热镇痛之效，因此，人参和西洋参具有并不完全相同的药理功效，在临床上要区别应用。另外，市场上西洋参的价格也远高于人参的价格。

为了用DNA指纹技术鉴别人参和西洋参，国内有的科学家从近300个随机引物中筛选了数个可产生特异指纹图谱的引物。比如，用一种特异引物对人参和西洋参分别进行DNA扩增，可扩增出二者共同的指纹条带2条，西洋参特有的指纹条带4条。根据扩增出的指纹条带的差异就可以进行人参与西洋参的鉴别。国内还有的科学家采用AFLP指纹图谱技术，首先用一种限制性核酸内切酶将人参与西洋参的基因组DNA切割成一系列短的片段，把这些短片段与一个人工接头连接后，用一系列不同的引物进行DNA扩增，可建立人参和西洋参的AFLP指纹图谱，经过计算机分析，就可以非常灵敏地鉴别出人参和西洋参来。

鹿茸是中国传统的名贵药材，《中国药典》规定其正品为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿尚未骨化但却密生茸毛的幼角，有壮肾阳、益精血、强筋骨的功效。由于鹿茸价格昂贵，市场上常有用狍、驼鹿或驯鹿等动物的角或其它骨块切片后制成的伪品。另外，也有用牛、猪或羊的筋腱来冒充鹿筋；用驯鹿鞭或牛鞭冒充鹿鞭的案例。

细胞色素b是细胞中电子传递链上的一个中间分子，在对梅花鹿、马鹿及其伪品的细胞色素b基因细致分析的基础上，科学家们设计了一对用于鉴定正品鹿类药材的特异引物。利用这对引物，只有从正品鹿茸、鹿筋和鹿鞭中才能扩增出一条大约365个核苷酸长的指纹条带，而伪品则不能扩增出这条特异的条带。

海马也是一种名贵中药材，《中国药典》收载海马属动物共五种，具温肾壮阳、散结消肿的功效。分别从五种海马中提取DNA，并对编码一种核糖体亚基的DN***段进行扩增，经过筛选发现有一种限制性核酸内切酶可以将这五种扩增出来的DNA切割成不同的长度，即具有所谓的长度多态性，根据这些切割产物长度的差异（特异指纹）就可以辨别出不同种的海马。

许多传统剂型的复方中成药中都含有部分甚至全部的生药成份，那么，能否利用DNA指纹图谱技术检测复方中成药中的特定生药成份呢？这方面的第一个应用来自于对中药《玉屏风散》中黄芪、白术和防风三味生药的检出。采用RAPD技术，从400个随机引物中筛选出了一个特异引物，用这个特异引物对从散剂中提取的总DNA进行扩增，结果可扩增出长度分别为200、440和500个核苷酸的特异指纹条带。这三个条带就分别代表黄芪、白术和防风三种生药成份。

目前，利用DNA指纹图谱技术对中药进行鉴定还基本上处于研究阶段，随着技术的不断进步，在不远的将来很可能成为一种常规的实验室鉴定手段，并为实现中药现代化作出应有的贡献