API4000定量分析方法的建立:
一、Q1 scan
1、用手动注射泵进样,流速设5ul/min,标准样浓度约1pmol/ul;
2、初调GS1和DP(使喷雾平稳、分析化合物信号灵敏度较高),GS1一般从10开始,一般用14。
3、Acquire采集并保存Q1MS做1.5分钟,确定化合物的母离子,(一定要找准,精确至小数点后一位数)
二、product ion
1、手动调节CE参数,使母离子具有一定强度,一般以母离子的强度占图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜。
2、点击Acquire,采集并保存MS2,确定化合物的子离子:在质谱图区域,点击右键“Open File”打开图谱,选择2个最高响应值的子离子,局部放大,确定子离子的质荷比,准确到0.1amu(以半峰宽为准)
三、MRM优化
以前两步选好的母离子、子离子组成离子对输入到右边的表格中,做MRM Scan,每个离子对的分析时间设100或200ms。(几对离子可同时优化)
通过Edit Ramp,分别优化Compound项下的各参数,如DP、EP、CE、CXP。
1、先优化DP找出各对离子的最好的DP值;
2、将每对离子的DP值增加填入右边的表格中,然后优化CE找出各对离子最好的CE值;
3、将每对离子的CE值增加填入右边的表格中,然后再对DP进行优化,将表格中第一次的DP值进行修改;
4、修改过DP值后再对CE进行一次优化并将新的CE值填入表格中;
5、对每对离子的EP进行优化;
6、对每对离子的CXP进行优化;
7、保存MRM方法。
四、将MRM方法转化为LC-MS/MS方法
1、连接
液相后将现有的质谱体系deactivte激活LCMS,打开先前保存的MRM方法,右键显示方法左边导引条中第一行Acquire Method,点击Add/Remove Device Method添加泵、自动进样器等相关模块,选中方法左边导引条中第一行Acquire Method参数页,设置色谱同步(LC SYNC)。
2、设置色谱参数,分析时间一般为0.8-1.0min,流动相组成和流量与实际样品分析时相同;修改质谱分析时间(Duration,一般设置0.8-1.0min,)与色谱参数一致;设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、500左右,保存方法。
3、将化合物溶液稀释100-1000倍,在Tune模式下,双击Quantitative Optimization,选择FIA分析,根据向导进行自动优化。
4、将FIA自动优化后的最优的GS1、GS2、TEM值填入方法中。
五、色谱条件优化
接好色谱柱,关掉Tune,在Acquire栏下调出上一步优化好的方法,根据色谱柱规格和待分析体系的复杂程度设置
液相流动相比例及分析时间和质谱分析时间,或编辑洗脱梯度,保存方法。
参考资料:
LC-MS/MS定量分析一般步骤-李立军API3200应该步骤也差不多,欢迎大家修正及补充……